[發(fā)明專利]一種抗菌肽電化學發(fā)光傳感器及其制備方法和檢測方法

有效

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• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104076025B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發(fā)明（設計）人: 欒崇林;代建國
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳職業(yè)技術(shù)學院
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,熊永強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物傳感技術(shù)和電化學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗菌肽電化學發(fā)光傳感器及其制備方法和檢測方法。

背景技術(shù)

抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的具備多種生物活性的小分子多肽，它具有熱穩(wěn)定性、廣譜抗菌以及潛在的抗腫瘤特性等優(yōu)點，因而廣泛應用于臨床醫(yī)學、醫(yī)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑和動植物抗病基因工程等領(lǐng)域?？咕牡幕钚?、作用機制、抗菌肽生產(chǎn)以及抗菌肽產(chǎn)品的質(zhì)量控制已經(jīng)成為抗菌肽研究的熱點問題，而這些問題的研究都急需準確、靈敏、簡便的抗菌肽定量檢測方法，尤其是能夠?qū)崿F(xiàn)在線分析的檢測方法。

目前抗菌肽的檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法和毛細管電泳法。但應用這些方法時，樣品預處理繁瑣，所需儀器昂貴且體積較大，檢測耗時長，而且對操作人員要求高，難以實現(xiàn)在線分析。

因此，如何實現(xiàn)低成本、靈敏和快速地在線檢測抗菌肽成為目前研究的重點。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種抗菌肽電化學發(fā)光傳感器及其制備方法和應用，所述抗菌肽電化學發(fā)光傳感器成本低，可以靈敏、快速地在線檢測抗菌肽；所述抗菌肽電化學發(fā)光傳感器的制備方法簡單易操作。

第一方面，本發(fā)明提供了一種抗菌肽電化學發(fā)光傳感器，所述抗菌肽電化學發(fā)光傳感器包括裸金電極、以及依次層疊設置在所述裸金電極表面的L-半胱氨酸層、納米金層和抗菌肽抗體層，所述抗菌肽抗體層與所述納米金層通過靜電吸附作用結(jié)合在一起。

優(yōu)選地，所述裸金電極和L-半胱氨酸層通過Au-S鍵結(jié)合在一起。

所述抗菌肽抗體層采用的抗菌肽來源于昆蟲、植物、哺乳動物、兩棲動物、海洋動物、鳥類、細菌和病毒等。

優(yōu)選地，所述抗菌肽抗體層采用的抗菌肽抗體為天蠶素B抗體。

L-半胱氨酸(Cys)是一種含有巰基的氨基酸，所述裸金電極和L-半胱氨酸層通過結(jié)合能很強的Au-S鍵連接，在裸金電極表面形成了穩(wěn)定的L-半胱氨酸層；L-半胱氨酸本身具有良好的電化學活性，可以促進電子轉(zhuǎn)移，增大了裸金電極面積，明顯增強所述抗菌肽電化學發(fā)光傳感器的電化學發(fā)光效果。同時，L-半胱氨酸具有良好的生物相容性。

納米金具有高比表面積、生物相容性及高導電活性，不僅可以降低電化學發(fā)光的初始電位，還能加快電極與免疫分子間的電子傳遞并增強電化學發(fā)光強度，提高電化學發(fā)光檢測的靈敏度及穩(wěn)定性。

優(yōu)選地，所述L-半胱氨酸層和納米金層通過靜電吸附作用結(jié)合在一起，納米金層可以增加抗菌肽抗體的固定量，改善生物分子微環(huán)境，具有最大量保持生物分子活性和活性分子定向固定等優(yōu)點。

所述納米金層和抗菌肽抗體層通過靜電作用結(jié)合在一起，納米金的引入不僅牢固的固定了抗菌肽抗體，加快了電子轉(zhuǎn)移速率。同時使固定的抗菌肽抗體達到定向排列、取向規(guī)則的目的，進一步提高生物分子的活性。所述納米金和抗菌肽之間是靜電吸附作用，因此多種抗菌肽抗體都可以和納米金通過靜電作用結(jié)合在一起形成電化學發(fā)光免疫傳感器，可以制備出不同種類的電化學發(fā)光免疫傳感器以定量檢測不同種類的抗菌肽。

優(yōu)選地，采用所述牛血清白蛋白封閉納米金層上的剩余位點。

所述牛血清白蛋白和抗菌肽抗體沒有特殊的要求，均可經(jīng)過市售得到。

所述抗菌肽電化學發(fā)光傳感器成本低，特異性強，抗干擾能力強，可簡化樣品的前處理過程，可以靈敏、快速地在線檢測抗菌肽含量。

第二方面，本發(fā)明提供了一種抗菌肽電化學發(fā)光傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)提供裸金電極，將所述裸金電極置于濃度為15～25mmol/L的L-半胱氨酸溶液中，采用循環(huán)伏安法在所述裸金電極表面電鍍L-半胱氨酸層，得到L-半胱氨酸層修飾的電極；所述循環(huán)伏安法的電壓范圍為-0.5～1.0V，掃描速度為5～15mV/s，電鍍時間為20～30min；

(2)在所述L-半胱氨酸層修飾的電極表面滴加納米金分散液，在4℃下靜置20～24h，在所述L-半胱氨酸層表面制備納米金層，得到納米金層和L-半胱氨酸層修飾的電極；

(3)在所述納米金層和L-半胱氨酸層修飾的電極表面滴加濃度為4～8μg/mL的抗菌肽抗體溶液，并在4℃下反應12～24h，在所述納米金層表面制備抗菌肽抗體層，所述抗菌肽抗體層與所述納米金層通過靜電吸附作用結(jié)合在一起，得到所述抗菌肽電化學發(fā)光傳感器。