[發(fā)明專利]噬菌體免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410272493.4
• 申請(qǐng)日: 2014-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN104046702A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華修德;王鳴華;劉鳳權(quán);施海燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/92
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種噬菌體免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法，利用噬菌體展示多肽，將免疫競(jìng)爭(zhēng)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)不含有核酸的小分子化合物的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)。

背景技術(shù)

有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus?pesticide，簡(jiǎn)稱OP)是一類廣泛用于防治病蟲害的農(nóng)藥。由于其具有高毒性，所以在使用過(guò)程中也會(huì)使一些非靶標(biāo)生物受到毒害。同時(shí)，隨著人們對(duì)食品和環(huán)境安全的關(guān)注，建立一種高通量、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的防控有著重要的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated?Isothermal?Amplification，LAMP)是2000年由日本科學(xué)家Notomi，T.首次在Nucleic?Acids?Research雜志上報(bào)道的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一條鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)保溫30-60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程，只需要恒溫環(huán)境。不僅大大降低了檢測(cè)的費(fèi)用，而且給檢測(cè)帶來(lái)極大方便。由于農(nóng)藥是不含核酸序列的小分子化合物，所以該方法在農(nóng)藥等小分子化合物中的應(yīng)用被忽略。

噬菌體展示技術(shù)是1985年由Smith，G.P.首次在Science雜志上報(bào)道，已經(jīng)作為一種強(qiáng)大的工具運(yùn)用在不同的研究中，包括篩選抗體和酶的配體；篩選小分子的受體；抗體工程等。其原理是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。當(dāng)噬菌體展示的多肽為隨機(jī)序列時(shí)為噬菌體展示多肽庫(kù)，利用抗體對(duì)噬菌體展示多肽庫(kù)進(jìn)行親和淘選，可篩選出能夠和抗體結(jié)合的噬菌體展示多肽。由于篩選出的多肽連接在噬菌體外殼蛋白上，并且噬菌體自身含有核酸，所以篩選出的多肽不需要與核酸模板連接，可直接被LAMP檢測(cè)。利用噬菌體展示多肽的特點(diǎn)，建立有機(jī)磷農(nóng)藥免疫LAMP檢測(cè)方法。該發(fā)明為食品安全檢測(cè)、農(nóng)產(chǎn)品等的出入境檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)部門的監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)手段和檢測(cè)方法。對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的可持續(xù)發(fā)展和食品安全問(wèn)題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)免疫LAMP方法在農(nóng)藥等其他小分子化合物上的應(yīng)用報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新穎、快速、靈敏和實(shí)用的噬菌體免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法，利用噬菌體展示多肽，將免疫競(jìng)爭(zhēng)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)不含有核酸的小分子化合物的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)。

本發(fā)明提供的噬菌體免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法，包括：

第一步：噬菌體展示多肽與分析物共同競(jìng)爭(zhēng)捕獲抗體的結(jié)合位點(diǎn)，

包被：用PBS緩沖液將抗體稀釋為10μg/mL后加入酶標(biāo)板，每孔100μL，37℃孵育2小時(shí)；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；封閉：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小時(shí)；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；加入分析物和噬菌體：每孔加入50μL分析物，再加入50μL的噬菌體，37℃孵育1小時(shí)；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；洗脫：每孔加入100μL?0.2M?pH2.2甘氨酸鹽酸緩沖液37℃洗脫15分鐘，洗脫后收集洗脫液并用1M?pH9.1?Tris-HCl進(jìn)行中和。

第二步：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合在捕獲抗體上的噬菌體，

以FIP、BIP為內(nèi)引物，以F3、B3為外引物對(duì)洗脫的噬菌體進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。其反應(yīng)體系為：0.64M?betaine，1mM?dNTPs，2.5μL?10×Bst?Buffer，8U?Bst?DNA聚合酶，150μM羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphthol?blue，HNB)，2μL中和后的噬菌體洗脫液，外引物各0.2μM，內(nèi)引物各1.2μM，ddH₂O補(bǔ)齊至25μL。將上述所有試劑混勻置于PCR管中，63℃?60min，80℃?10min終止反應(yīng)。

第三步：免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物分析及結(jié)果判定，