[發明專利]噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法

有效

• 申請號: 201410272493.4
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN104046702A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 華修德;王鳴華;劉鳳權;施海燕
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/92
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法，其特征包括：

第一步：噬菌體展示多肽與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點，

包被：用PBS緩沖液將抗體稀釋為10μg/mL后加入酶標板，每孔100μL，37℃孵育2小時；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；封閉：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小時；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；加入分析物和噬菌體：每孔加入50μL分析物，再加入50μL的噬菌體，37℃孵育1小時；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；洗脫：每孔加入100μL0.2M?pH2.2甘氨酸鹽酸緩沖液37℃洗脫15分鐘，洗脫后收集洗脫液并用1M?pH9.1Tris-HCl進行中和。

第二步：環介導等溫擴增結合在捕獲抗體上的噬菌體，

以FIP、BIP為內引物，以F3、B3為外引物對洗脫的噬菌體進行恒溫擴增。其反應體系為：0.64M?betaine，1mM?dNTPs，2.5μL?10×Bst?Buffer，8U?Bst?DNA聚合酶，150μM羥基萘酚藍(hydroxynaphthol?blue，HNB)，2μL中和后的噬菌體洗脫液，外引物各0.2μM，內引物各1.2μM，ddH₂O補齊至25μL。將上述所有試劑混勻置于PCR管中，63℃?60min，80℃?10min終止反應。

第三步：免疫環介導等溫擴增反應產物分析及結果判定，

分析方法1：瓊脂糖凝膠電泳：取3μL擴增產物，加入1μL上樣緩沖液(購自TAKARA公司)，混勻，在2％(W/V)瓊脂糖凝膠中101V下電泳1小時，用溴化乙錠(EB)染色15min后，在凝膠成像系統上成像；

分析方法2：在日光下用肉眼觀察結果。

結果判定：在分析方法1中，在凝膠成像系統的紫外燈下觀察是否有梯形條帶，若有條帶為陰性，若無條帶為陽性。在分析方法2中，若擴增產物的顏色變為天藍色則為陰性，若保持深藍色不變為陽性。

2.根據權利要求1所述的噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法，其特征在于利用噬菌體展示多肽，將免疫競爭和環介導等溫擴增結合，實現對不含有核酸的小分子化合物的環介導等溫擴增檢測。

3.根據權利要求1和2所述的噬菌體展示多肽為展示在M13噬菌體外殼蛋白上的小分子模擬表為多肽。

4.權利要求1所述的環介導等溫擴增引物是根據M13噬菌體ssDNA特異性序列設計。