[發明專利]一種高產丙酸詹氏丙酸桿菌工程菌及其應用

在審

• 申請號: 201410271329.1
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN104004700A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉龍;諸葛鑫
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P7/52;C12R1/01
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種高產丙酸詹氏丙酸桿菌工程菌及其應用，屬于遺傳工程領域。

背景技術

丙酸及其衍生物在工業上的應用領域十分廣泛，主要應用于食品防腐、飼料儲藏、醫藥中間體合成、農業除莠劑合成、有機合成中間體等方面。2006年世界丙酸總生產能力在35萬噸/年左右，2008年達到50萬噸/年。美國是世界上最大的丙酸生產及消費國。目前我國丙酸實際年產量只有200噸左右，遠遠不能滿足實際的市場需求，每年仍需大量進口來彌補國內的空缺。

詹氏丙酸桿菌(Propionibacterium?jensenii)屬于丙酸桿菌屬，為厭氧菌，是一類G⁺、不產芽孢、不運動、接觸酶陽性的厭氧菌。菌落呈現白色、黃色或者褐紅色。一般情況下，最適pH為6.5～7.5，最適生長的溫度為28℃～37℃。

丙酸的生產方法有化學合成法和微生物發酵法，化學合成法是以石油等化工產品為原料，經過加溫、加壓利用催化劑合成丙酸的方法，該方法是工業級規模上丙酸的主要生產方法。微生物發酵法是丙酸菌在常溫、常壓下利用一般營養源通過自身代謝產生丙酸。由于微生物發酵生產丙酸能降低對石油等不可再生能源的依賴性，減輕對環境造成的壓力，因此，在當前全世界面臨環境污染、能源短缺的嚴峻情況下，微生物發酵法生產丙酸為丙酸合成提供了新的思路，同時得到了越來越多研究者的關注。但是微生物法生產丙酸仍然存在成本高，丙酸產量低等缺點。丙酸桿菌的主要碳源是甘油，然而在其代謝途徑中，詹氏丙酸桿菌對甘油的利用率并不高，從而導致碳源轉化成產物的效率低下，最終導致丙酸產量低。因此，需要過量表達甘油代謝途徑中的第一步中的相關酶即甘油脫氫酶基因(gldA)以提高丙酸桿菌對甘油的利用率，最終達到提高丙酸的產量的目的。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種高產丙酸詹氏丙酸桿菌工程菌，是以詹氏丙酸桿菌(Propionibacterium?jensenii)為宿主，過量表達來自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella?pneumonia?subsp.pneumoniae?ATCC?12657)的蘋果酸脫氫酶基因mdh，或者同時還過量表達來自肺炎克雷伯氏菌的甘油脫氫酶基因gldA。

所述詹氏丙酸桿菌優選詹氏丙酸桿菌JN926?CCTCC?No：M?2013071。

所述甘油脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示。

所述甘油脫氫酶基因和蘋果酸脫氫酶基因通過表達載體pZGX04進行表達。

所述表達載體pZGX04的構建方法參見文獻Zhuge,X.,Liu?L.,Shin,H.D.,Chen,R.R.,Li,J.,Du,G.,Chen,J.,2013.Development?of?a?Propionibacterium-Escherichia?coli?shuttle?vector?as?a?useful?tool?for?metabolic?engineering?of?Propionibacterium?jensenii,an?efficient?producer?of?propionic?acid.Appl.Environ.Microbiol.79,4595-4602。

本發明還提供構建所述工程菌的方法，是將來源于肺炎克雷伯氏菌的蘋果酸脫氫酶基因mdh單獨過量表達于詹氏丙酸桿菌中，或將mdh與編碼甘油脫氫酶的gldA基因共表達于詹氏丙酸桿菌中，以提高甘油的利用率，從而提高甘油代謝途徑通量，并最終導致丙酸生產強度以及產量的提高。

所述方法優選以下步驟：以肺炎克雷伯氏菌Klebsiella?pneumonia?subsp.pneumoniae?ATCC?12657全基因組序列為模板，PCR擴增得到或采用化學全合成的方法獲得mdh目的片段。通過平末端連接將其克隆入質粒pZGX04(Zhuge?et?al.,2013)，得到mdh基因表達質粒pZGX04-mdh。構建好的重組質粒pZGX04-mdh經DNA測序證明，表明重組質粒構建正確。將重組質粒用電擊轉化的方法，轉入受體菌Propionibacterium?jensenii，在SLB培養基上進行隨即挑選，利用菌落PCR的方法進行篩選，得到蘋果酸脫氫酶過量表達的重組菌。