[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于熒光定量PCR檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410270207.0
• 申請(qǐng)日: 2014-06-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104004852A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴鵬高;尋曉潔;陳超;鄒暉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂(lè)

1.一種基于熒光定量PCR檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的方法，用于非疾病診斷目的，包括以下環(huán)節(jié)：

(1)基因特異性引物的設(shè)計(jì):

針對(duì)CYP2A6基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合，序列如下:

上游引物:5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’

下游引物:5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’

探針:5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’

針對(duì)ALB基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合，序列如下:

上游引物:5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

下游引物:5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

探針:5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’

其中，F(xiàn)AM為6-carboxyfluorescein；HEX為6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2為Black?Hole?Quencher-2；

(2)模板的制備:提取待測(cè)樣本的基因組DNA；

(3)實(shí)時(shí)定量PCR:

以反應(yīng)體系總量20μL計(jì)，在同一個(gè)反應(yīng)體系中，加入CYP2A6基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-200nM、以及ALB基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-200nM、2×Mastermix10μL、待測(cè)樣本的基因組DNA10-50ng，H₂O補(bǔ)足體積20μL；

(4)結(jié)果判定:將配制好的反應(yīng)體系在熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)儀器給出的兩基因的擴(kuò)增指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果判定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光定量PCR檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的方法，其特征在于，熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行的擴(kuò)增過(guò)程的擴(kuò)增參數(shù)為：95℃，2～15min，不循環(huán)；95℃，5～10sec，60℃，20-30sec，68℃，20～30sec，共計(jì)35～40個(gè)循環(huán)。

3.一種用于熒光定量PCR檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1中所述的針對(duì)CYP2A6基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合、針對(duì)ALB基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合、以及2×Mastermix和H₂O。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：以試劑盒中的試劑總量20μL計(jì)，CYP2A6基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-200nM、以及ALB基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-200nM、2×Mastermix10μL，H₂O補(bǔ)足體積20μL。