[發(fā)明專利]一種基于熒光定量PCR檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410270207.0
• 申請(qǐng)日: 2014-06-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104004852A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴鵬高;尋曉潔;陳超;鄒暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標(biāo)代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂(lè)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的方法。

背景技術(shù)

CYP2A6基因是人細(xì)胞色素P450基因超家族的一員，其編碼的蛋白為一種重要的代謝酶，參與多種藥物及有毒化合物在人體內(nèi)的代謝。CYP2A6基因在人群中表現(xiàn)出廣泛的多態(tài)性，其中CYP2A6全基因缺失在中國(guó)人群中的發(fā)生頻率為5％-15％。

替加氟以及以替加氟為主要活性成分的化合物是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的抗嘧啶類藥物，對(duì)消化道腫瘤及等多種實(shí)體瘤均有良好治療效果。

大量研究表明，CYP2A6全基因缺失多態(tài)性與S-1和UFT等以替加氟為活性成分的藥物的藥效密切相關(guān)。未攜帶該多態(tài)性的患者相對(duì)于發(fā)生基因缺失的患者有更高的藥物應(yīng)答率和更長(zhǎng)的生存時(shí)間。此外，CYP2A6全基因缺失多態(tài)性與人對(duì)尼古丁的依賴性(煙癮)及多種癌癥的易感性都有緊密的聯(lián)系。

傳統(tǒng)檢測(cè)CYP2A6全基因缺失多態(tài)性的技術(shù)主要是PCR-凝膠電泳。這種方法成本低，重復(fù)性好，然而需要多次的PCR后處理，既操作復(fù)雜，又容易發(fā)生污染而產(chǎn)生假性結(jié)果。SmartPCR技術(shù)很大程度上彌補(bǔ)了PCR-凝膠電泳技術(shù)的不足之處，可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出CYP2A6全基因純合缺失，然而其無(wú)法檢測(cè)出CYP2A6全基因雜合缺失的樣本。

基于實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量的方法已成功應(yīng)用于基因缺失的檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是設(shè)計(jì)一套引物探針組合來(lái)特異性擴(kuò)增待檢測(cè)的目的基因(靶基因)，同時(shí)設(shè)計(jì)一套引物探針組合來(lái)擴(kuò)增一個(gè)在人基因組中保持拷貝數(shù)高度穩(wěn)定的基因(內(nèi)參基因)。在一次實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中，同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本的靶基因和內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)二者的擴(kuò)增指標(biāo)(Ct值)，計(jì)算二者拷貝數(shù)的比例。在未發(fā)生基因缺失的情況(也未發(fā)生異常擴(kuò)增)，靶基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比例應(yīng)該是1:1，即兩種基因在基因組中均以正常二倍體的形式存在；而當(dāng)靶基因發(fā)生雜合缺失的情況下，靶基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比例應(yīng)該是0.5:1，即內(nèi)參基因以正常二倍體的形式存在，而靶基因則只呈現(xiàn)出單倍體的狀態(tài)；而當(dāng)靶基因發(fā)生純合缺失時(shí)，擴(kuò)增靶基因的引物探針組合不能產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)，而內(nèi)參基因的擴(kuò)增則正常。在進(jìn)行樣本檢測(cè)時(shí)，只需將一個(gè)未發(fā)生基因缺失的樣本作為對(duì)照(質(zhì)控品)，則可以很清楚地判斷待檢測(cè)樣本是否發(fā)生了基因缺失，以及該缺失是雜合狀態(tài)還是純合狀態(tài)。

然而，該技術(shù)至今未見(jiàn)應(yīng)用于CYP2A6全基因缺失的檢測(cè)；其根本原因是CYP2A6基因與CYP2A7基因及CYP2A13基因具有非常高的序列同源性(90％以上)，因而設(shè)計(jì)一套適宜于熒光定量PCR反應(yīng)高特異性擴(kuò)增CYP2A6基因的引物探針組合十分困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種基于熒光定量PCR檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的方法，通過(guò)分別設(shè)計(jì)針對(duì)于CYP2A6基因和白蛋白基因(ALB)的高特異性引物，利用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)快速準(zhǔn)確檢測(cè)CYP2A6全基因缺失的方法。

為實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。

該檢測(cè)方法包括以下環(huán)節(jié)：

(1)基因特異性引物的設(shè)計(jì)

針對(duì)CYP2A6基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合，序列如下:

Fp(上游引物):5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’

Rp(下游引物):5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’

Probe(探針):5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’

針對(duì)ALB基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合，序列如下:

Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

Probe(探針):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’

其中，F(xiàn)AM為6-carboxyfluorescein；HEX為6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2為Black?Hole?Quencher-2

(2)模板的制備:提取待測(cè)樣本的基因組DNA；

(3)實(shí)時(shí)定量PCR:針對(duì)環(huán)節(jié)(1)中的兩種特異性引物，建立被測(cè)樣本的檢測(cè)體系：