[發明專利]一種控制輪蟲攜帶的總細菌數的方法

無效

• 申請號: 201410269825.3
• 申請日: 2014-06-17
• 公開（公告）號: CN104126530A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 蔡俊鵬;孫秋平
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: A01K61/00
• 分類號: A01K61/00;C02F3/34;A61K35/74;C12N1/20;C12R1/01;A61P31/04
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于蛭弧菌技術領域，特別涉及一種控制輪蟲攜帶的總細菌數的方法。

背景技術

輪蟲(英文名rotifer)常見于世界各處的淡水中，同時在咸水、咸淡水或海水中也多有發現。多數自由游泳，有些寄生。常見的有旋輪屬、豬吻輪屬、腔輪屬和水輪屬等，為目前大規模工業水產養殖中，許多海洋魚類和蝦類不可缺少的活食用生物。其營養方式單一，成活率高、來源廣泛，同時又具備營養豐富、方便水產動物攝食等特點，從而被廣泛應用于水產養殖業中，重點用于飼喂水產生物幼體。與有機傳統餌料相比，使用輪蟲投喂水產生物幼體具有成本低、幼體成活比高等優勢。但是，如果輪蟲自身攜帶過多細菌，那么將對輪蟲的生存及養殖應用造成巨大影響及危害。總細菌數目過多，潛在的致病菌存在的可能性也就更大，其中可能存在的致病菌的種類和數目也會增加，會給對其進行慮食的水產生物幼體造成病害。養殖戶在水產生物育苗的過程中，會對引入的輪蟲等餌料進行簡單的過濾，或對其施用消毒劑以達到消毒的目的，這不但影響了輪蟲的活性、可能還會引入新的細菌，更有可能在一定程度上殺死輪蟲等浮游生物，同時破壞了養殖的水生生態環境，對水產生物的育苗產生不利影響。

因此，在使用輪蟲作為優質餌料對水產生物育苗時，都應當對于其中攜帶的全部細菌引起重視。國內的許多研究都致力于將蛭弧菌制劑應用于控制病原菌，利用蛭弧菌天然的生物裂解活性，將蛭弧菌制劑施用于水體當中，可有效控制水體中的總細菌數目，從而降低其對于水產生物造成侵害的可能，從源頭上控制水產生物病害的發生。目前將蛭弧菌制劑應用于控制水生浮游生物輪蟲所攜帶的的總菌尚無報道。為了有效保障養殖水體及活生物餌料輪蟲等的安全性，簡單的消毒處理方式已無法滿足需求。

應用蛭弧菌制劑控制輪蟲所攜帶的的總菌，從源頭上對水產養殖中存在的可能致病細菌進行防控，以形成具有疾病防預功能的養殖生態系統，具有十分重要的意義。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種控制輪蟲攜帶的總細菌數的方法。該方法創新性提出了一種蛭弧菌制劑在控制有益浮游生物輪蟲所攜帶的總菌的方式；并可以適當的延長其制劑中的菌體活性。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種控制輪蟲攜帶的總細菌數的方法，包括以下步驟：

(1)制備蛭弧菌稀釋液；

(2)將步驟(1)制備的蛭弧菌稀釋液與保護劑進行混合，即得到蛭弧菌制劑；

(3)含輪蟲的水樣的預處理；

(4)將步驟(2)獲得的蛭弧菌制劑與步驟(3)的含輪蟲的水樣進行混合。

所述的蛭弧菌優選為蛭弧菌(Bdellovibrio?sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M209170；對所述的蛭弧菌進行進行負染后于電子顯微鏡下觀察形態可知：BDS02呈單細胞，弧形，大小為0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛長度為1.8μm；所述蛭弧菌BDS02用雙層平板培養的方法于28℃培養四天可形成直徑1～2mm的透明圓形噬菌斑；

所述的蛭弧菌稀釋液優選通過以下步驟獲得：

①宿主菌濃縮液的制備：挑取大腸桿菌單菌落(大腸桿菌E.coli，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GIM1.355)，接種于營養肉湯液體培養基中，培養，得到培養液，然后將培養液離心，棄上清，每100mL培養液收集的沉淀用2～3mL?DNB(diluted?nutrient?broth)液體培養基懸浮，得到宿主菌濃縮液，4℃保存備用；

②蛭弧菌稀釋液的制備：按照蛭弧菌：宿主濃縮液：DNB液體培養基的體積比1:1:50的比例進行混合，恒溫培養，每24h添加一次宿主濃縮液，培養48h，得到培養液；將培養液離心，取上清液過濾，濾液使用質量體積比(g/mL)1.5％鹽度的滅菌蒸餾水調整其濃度，制備得到2×10³～2×10⁶PFU(plaque-forming?unit)/mL的蛭弧菌稀釋液；

所述的蛭弧菌優選為蛭弧菌(Bdellovibrio?sp.)BDS02，為2009年8月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M209170；

步驟①中所述的營養肉湯液體培養基優選為營養肉湯18g/L，pH7.2，121℃高壓滅菌15min后保存備用；

步驟①中所述的培養的條件優選為200rpm、28℃培養18h；

步驟①中所述的離心的條件優選為4℃、6000rpm離心20min；