[發(fā)明專利]一種利用紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410269440.7
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104073529B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 穆紅梅
• 申請（專利權(quán)）人: 聊城大學(xué)
• 主分類號: C12P17/02
• 分類號: C12P17/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及紫杉醇的產(chǎn)生，特別是一種通過紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法。?

背景技術(shù)???

紫杉醇（Taxol），是從紅豆杉屬?(Taxus??spp.)?植物中分離得到的一種具有獨(dú)特抗癌作用的二萜類化合物，具有很高的開發(fā)利用價值，是目前世界主流的抗癌藥物之一。化學(xué)名稱:?5β，20-環(huán)氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯]。化學(xué)式為?C₄₇H₅₁NO₁₄，分子量是?853.92，白色結(jié)晶體粉末，無臭，無味，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)?213～216℃。1967年美國北卡羅萊納州三角研究所的Wall博士和Wani博士發(fā)現(xiàn)了紫杉醇。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇能與微管緊密地結(jié)合，是已知的第一種能和微管蛋白聚合體相互作用從而抑制細(xì)胞有絲分裂的藥物。美國國家癌癥研究所和約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院大量臨床研究的數(shù)據(jù)表明，紫杉醇在治療卵巢癌和乳腺癌方面效果顯著。

1992年12月，美國國家食品與藥品管理中心正式批準(zhǔn)：紫杉醇為晚期卵巢癌的治療藥物。隨后又批準(zhǔn)用于治療乳腺癌。目前紫杉醇是最好的治療卵巢癌和乳腺癌的藥物，價格非常昂貴，市場售價為4800美元/克。1994年紫杉醇創(chuàng)世界抗癌藥物全球銷量冠軍。2000年紫杉醇銷量創(chuàng)百億（后受原料供應(yīng)未有進(jìn)一步上升），但由于野生紅豆杉資源瀕危，2002年中央發(fā)文嚴(yán)禁砍伐野生紅豆杉，鼓勵人工種植。今天，紫杉醇已經(jīng)被成功地用于對多種惡性腫瘤的治療（包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤等）。?

但是紫杉醇的自然資源---紅豆杉和東非羅漢松（1999年測知含紫杉醇）數(shù)量有限且生長地十分緩慢。且其中有效成分的含量非常低（每公斤樹皮僅能提取0.1g紫杉醇粗品）。最初，用于治療的紫杉醇都來源于太平洋紅豆杉，治療一個病人需要6棵百年樹齡的紅豆杉。盡管現(xiàn)在紫杉醇以及它的抗癌同源衍生物可以通過其前體進(jìn)行化學(xué)半合成制得。但是部分前體還需要從紅豆杉中分離得到，產(chǎn)量受到制約。?

目前，生產(chǎn)紫杉醇原料藥有以下幾種途徑：①直接從紅豆杉樹皮或整株紅豆杉植株中提取；?②半合成法，即先從紅豆杉中提取10-DAB等中間體，再經(jīng)合成為紫杉醇成品；?③培養(yǎng)能產(chǎn)生紫杉醇的紅豆杉細(xì)胞?；④全合成法，但由于步驟多，成本高尚未投入生產(chǎn)；⑤發(fā)酵法：培養(yǎng)寄生在紅豆杉樹木身上的某些真菌來獲取紫杉醇。其中發(fā)酵法屬于“環(huán)境友好型”工藝，利用來源豐富的淀粉類原料，屬于綠色農(nóng)產(chǎn)品原料。而且對環(huán)境無污染，科學(xué)家普遍認(rèn)為，真菌發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇代表著紫杉醇生產(chǎn)的未來方向。?

發(fā)明內(nèi)容

針對紫杉醇原料藥市場缺口較大的問題，本發(fā)明目的是提供一種通過紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法。?

本發(fā)明的技術(shù)方案是：?

一種利用紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法，以紅豆杉種子為外植體，經(jīng)滅菌、接種、二次滅菌、接種，誘導(dǎo)紅豆杉種子內(nèi)生菌，再培養(yǎng)紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法。

前面所述的方法，優(yōu)選的方案在于：步驟如下：?

A、外植體的選擇和滅菌處理：以‘曼地亞’紅豆杉（Taxus?media）種子為外植體，以洗潔精浸泡，搖床100-150轉(zhuǎn)搖15-20分鐘，再用清水沖洗，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1%的升汞中，浸泡滅菌，無菌去離子水沖洗，備用；

B、外植體接種：將經(jīng)過步驟A中準(zhǔn)備的外植體種子，接種在含有赤霉素0.3mg/L的SH培養(yǎng)基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7.5g/L，pH5.8，培養(yǎng)，至在種子周圍有菌絲形成；

C、二次滅菌：將步驟B中得到的種子用0.1%氯化汞二次滅菌，無菌水沖洗7-8次；

D、內(nèi)生菌的誘導(dǎo)：將經(jīng)過步驟C中得到的外植體種子，繼續(xù)培養(yǎng)于含有赤霉素0.3mg/L的SH培養(yǎng)基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7.5g/L，pH5.8，至出現(xiàn)紅豆杉種子內(nèi)生菌；

E、內(nèi)生菌培養(yǎng)：將步驟D中得到的紅豆杉種子內(nèi)生菌置于PDA固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后再挑取部分菌斑置于PDA?液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后檢測紫杉醇含量；