[發(fā)明專利]一種利用紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410269440.7
• 申請(qǐng)日: 2014-06-18
• 公開（公告）號(hào): CN104073529B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 穆紅梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 聊城大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P17/02
• 分類號(hào): C12P17/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種利用紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法，其特征在于：以紅豆杉種子為外植體，經(jīng)滅菌、接種、二次滅菌、接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生紅豆杉種子內(nèi)生菌，再培養(yǎng)紅豆杉種子內(nèi)生菌產(chǎn)生紫杉醇的方法。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟如下：

A、外植體的選擇和滅菌處理：以‘曼地亞’紅豆杉（Taxus?media）種子為外植體，以洗潔精浸泡，搖床100-150轉(zhuǎn)搖15-20分鐘，再用清水沖洗，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1%的升汞中，浸泡滅菌，無(wú)菌去離子水沖洗，備用；

B、外植體接種：將經(jīng)過(guò)步驟A中準(zhǔn)備的外植體種子，接種在含有赤霉素0.3mg/L的SH培養(yǎng)基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7.5g/L，pH5.8，培養(yǎng)，至在種子周圍有菌絲形成；

C、二次滅菌：將步驟B中得到的種子用0.1%氯化汞二次滅菌，無(wú)菌水沖洗；

D、內(nèi)生菌的誘導(dǎo)：將經(jīng)過(guò)步驟C中得到的外植體種子，繼續(xù)培養(yǎng)于含有赤霉素0.3mg/L的SH培養(yǎng)基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7.5g/L，pH5.8，至出現(xiàn)紅豆杉種子內(nèi)生菌；

E、內(nèi)生菌培養(yǎng)：將步驟D中得到的紅豆杉種子內(nèi)生菌置于PDA固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后再挑取部分菌斑置于PDA?液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后檢測(cè)紫杉醇含量；

F、紫杉醇提取：將步驟E中的發(fā)酵物用紗布過(guò)濾，將濾液部分用等體積的乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相，取水相部分再用等體積的乙酸乙酯萃取1次，收集有機(jī)相，菌絲部分經(jīng)液氮研碎，超聲處理，靜置過(guò)夜后用等體積的乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相，重復(fù)處理1次，將所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在35℃下旋蒸至液體全部蒸發(fā)，殘留物體用溶解于少量甲醇中，濾膜過(guò)濾，定容至10mL備用；

G、紫杉醇提取含量檢測(cè)：經(jīng)HPLC檢測(cè)，真菌產(chǎn)生的發(fā)酵物中含有紫杉醇，平均含量為0.315mg/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物‘曼地亞’紅豆杉（Taxus?media）。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟A、外植體的選擇和滅菌處理時(shí)：所用洗潔精濃度為2%～3%，浸泡和沖洗時(shí)間為15-30分鐘，0.1%的氯化汞浸泡滅菌時(shí)間為9-14分鐘，無(wú)菌去離子水沖洗次數(shù)為6-8次。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟B、外植體接種時(shí)：培養(yǎng)時(shí)間為3-5天。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟C、二次滅菌時(shí)：二次滅菌時(shí)間為8-12min，無(wú)菌水沖洗6-8次。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟D、內(nèi)生菌的誘導(dǎo)時(shí)：培養(yǎng)溫度為21±2℃，光照強(qiáng)度為1600Lux，光照時(shí)間為14小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為7-10天。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟E、內(nèi)生菌培養(yǎng)：液體培養(yǎng)時(shí)，每個(gè)三角瓶的接種量為?2%，裝液量為?200mL?/?500mL，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為?27℃，轉(zhuǎn)速為?150r?/?min。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟F、紫杉醇提取：超聲處理時(shí)間為25-35min，濾膜過(guò)濾時(shí)用0.45μm濾膜。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟G、紫杉醇提取含量檢測(cè)：色譜條件為：C18柱?：250mm×46mm?；流動(dòng)相，甲醇：水(v/v)=60：40；壓力：1506PSI=10.39MPa；保護(hù)壓力：100LO-Pr；流速O．7mL/?min，檢測(cè)波長(zhǎng)228nm，靈敏度，0.1AUf's，柱溫35℃。