[發明專利]一種Indel分子標記芯片的利用方法

有效

• 申請號: 201410268224.0
• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN104017880A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 溫常龍;于拴倉;許勇;王永勤;董從娟
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京五洲洋和知識產權代理事務所(普通合伙) 11387
• 代理人: 劉春成;榮紅穎

技術領域

本發明屬于芯片制備領域，具體涉及一種Indel分子標記的利用方法，該利用方法是將Indel分子標記設計為探針并將探針制作成芯片。

背景技術

基因芯片(gene?chip)的原型是80年代中期提出的，它是在基因探針的基礎上研制出來的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測的物質，根據堿基互補的原理，利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析?；蛐酒砂汛罅糠肿訖z測單元集成在一個微小的固體基片表面，可同時對大量的核酸分子實現高效、快速、低成本的檢測和分析。

早在八十年代，Bains?W.等人就將短的DNA片斷固定到支持物上，借助雜交方式進行序列測定。基因芯片技術可以用來篩選蔬菜作物的基因突變，并尋找高產、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關基因。

目前，主要蔬菜作物的基因組測序工作基本完成，其中，我國科學家牽頭或作物主要參與方先后完成了西瓜、白菜、黃瓜、番茄、甘藍基因組序列測定工作。另外，甜瓜、辣椒等蔬菜作物的基因組也已發表，利用基因組學開展蔬菜作物分子生物學研究已邁入新的階段。作為高通量篩選的代表技術基因芯片也逐步應用于蔬菜作物研究?；蛐酒谑卟俗魑镉N研究中具有廣闊的應用前景，可用于遺傳材料前景選擇、背景鑒定、基因定位、基因聚合鑒定篩選、核酸指紋分析、種子真實度鑒定等多個方面。現在市場上常見的分子標記基因芯片多為SNP(單核苷酸差異)檢測芯片，對于多堿基差異分子標記SSR(簡單重復序列)、Indel(插入缺失差異)等分子標記芯片研究鮮有報道。但是由于蔬菜作物的分子生物學基礎研究尚落后于模式植物擬南芥和糧食作物水稻、玉米。目前，進行性狀定位研究，可用于分子標記輔助選擇的分子標記大多為SSR、Indel，SNP分子標記較少；而與SSR分子標記相比，Indel分子標記探針涉及的基因重復序列較少，在全基因組背景下具有更好的保守性和多態性。而且，Indel分子標記較易設計開發共顯性探針，即插入/缺失分別長片段探針和短片段探針；經過雜交反應，其中一方有信號為純合，雙方都有雜交信號為雜合的共顯性探針。因此，Indel分子標記更適宜于進行芯片探針設計和開發應用。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的在于提供一種Indel分子標記芯片的利用方法。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種Indel分子標記芯片的利用方法，依次包括如下步驟：

根據Indel分子標記設計合成覆蓋全基因組的Indel探針步驟；

合成的Indel探針點樣于基片的點樣步驟：先將合成的Indel探針干粉用去離子水配制成濃度為18-22μM的Indel探針溶液，再將所述探針溶液與點樣緩沖液等體積混合均勻，然后將混合均勻的樣品轉移至多孔板上，并將基片置于點樣儀上，按點樣儀的點樣程序將所述多孔板上的樣品點樣于基片上，從而得到Indel分子標記芯片；

所述Indel分子標記芯片的固定步驟；

在固定后的所述Indel分子標記芯片上進行雜交的步驟：首先，根據點樣模式，在固定后的芯片周圍貼上相應的圍欄或反應艙，在所述圍欄或反應艙內加入預雜交液，38-42℃放置15-20min后去除預雜交液；然后，將包含Indel分子標記的模板(比如PCR產物模板或基因組片段化后的模板等)進行98℃10min變性，變性后即刻將裝有所述模板的離心管置于冰水混合物中并于-20℃條件下放置5-10min；之后，向裝有所述模板的離心管中加入雜交緩沖液，混合均勻后加入至已經過預雜交液處理的芯片的圍欄或反應艙中，其中所述模板與雜交緩沖液的體積比為1:4-6；最后，將芯片置于濕盒，在40℃～60℃烘箱中進行雜交，雜交時間為1～16h；

雜交后的Indel分子標記芯片的洗脫與掃描步驟：吸去芯片上的溶液后加入洗液，于38-42℃下放置5-10min，再吸干或離心甩干芯片，進行基因芯片熒光掃描。

在上述利用方法中，作為一種優選實施方式，在所述點樣步驟中，在向所述基片點樣之前將多孔板在離心機上離心以使樣品沉淀到孔的底部。

在上述利用方法中，作為一種優選實施方式，所述基片為氨基基片或醛基基片。