[發明專利]一種轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法

在審

• 申請號: 201410267627.3
• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN104031936A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 李哲;畢政鴻;戴雪梅;黃華孫;林位夫;周建南
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，尤其涉及一種轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法。

背景技術

植物體細胞胚發生和器官發生是極其復雜的過程。近年來的研究表明，眾多基因參與了植物體細胞胚發生的調控，其中WUS(WUSCHEL)基因是一個典型的干細胞決定基因。1996年Laux等利用EMS誘變技術鑒定了WUS，發現其基因突變體影響著頂端分生組織和花分生組織的發育，由此推斷WUS在頂端分生組織和花分生組織中起著關鍵性的作用，并維持著結構和功能的統一。Mayer等研究發現WUS編碼291個氨基酸，是同源域蛋白(homeodomainprotein)中的一個新亞型。在植物胚胎發育過程中，WUS基因在16細胞胚的中央4個細胞中表達，魚雷胚時期表達區域下移到第3層細胞，而在胚晚期以及胚后莖尖分生組織中，WUS在第3層細胞之下表達。在頂端分生組織中，干細胞組織中心表達的WUS決定其上的細胞成為干細胞，而由干細胞所表達的CLV3蛋白通過細胞間隙移動到干細胞組織中心的周邊，通過WUS/CLV3之間的反饋調節環來完成器官的啟動和干細胞的維持。Zuo等(2002)用T-DNA標簽法篩選出pga6突變體，用一種化學誘導的激活標簽系統鑒定了擬南芥PGA6基因的兩個等位基因，當它們被誘導過度表達時，在不添加任何外部激素的情況下，所有被檢測的組織和器官高頻率地形成體細胞胚。當誘導劑取消時，所有這些體細胞胚可以直接萌發成可育的成年植株。經分析PGA6與WUSCHEL(WUS)相同。研究結果表明WUS/PGA6在體細胞胚發生過程中也有關鍵作用，可能是通過促進營養性向胚性的轉變、和/或保持胚性干細胞的性質而起作用的。

Li等(2004)用含有35S-35S-WUS的植物表達載體pBKB轉化煙草使WUS基因增強表達，結果轉基因煙草地上部分出現許多異常的細胞分裂和異位器官發生，形成許多突起，掃描電子顯微鏡分析表明突起由許多小而密集的細胞組成，類似分生組織細胞；部分突起能夠發育成分生組織或花芽，表明WUS基因與器官發生有關。Arroyo-Herrera等(2008)利用誘導型啟動子將WUS基因轉入咖啡中誘導WUS基因的超表達，結果體細胞胚的發生提高了4倍。

天然橡膠是國家重要戰略資源，天然橡膠的主要來源是橡膠樹(Heveabrasiliensis)，橡膠樹組織培養體細胞胚發生和植株再生是橡膠樹生物技術研究的重要內容。當前，從橡膠樹組織培養高頻率地得到再生植株仍然存在著困難。植物體細胞胚發生和器官發生重要基因的分子機理研究為橡膠樹組織培養植株再生的遺傳性狀改良提供了一條新的途徑。目前生產上橡膠樹種植主要是用芽接樹，用生產上表現性狀良好的母本植株的芽條作為接穗，以實生苗作為砧木進行嫁接。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法，以解決橡膠樹組織培養過程中側芽發生難的問題，所取得的側芽、側枝有實際應用于嫁接的潛力。

本發明實施例是這樣實現的，一種轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法，該轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法包括：

步驟一，擬南芥AtWUS基因克隆和植物表達載體構建，克隆擬南芥AtWUS基因，構建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表達載體；

步驟二，根據uidA基因瞬時表達率的多少和細胞存活率的高低，結合影響根癌農桿菌遺傳轉化的相關因素，相關因素包括預培養時間、菌液濃度、乙酰丁香酮AS濃度、侵染時間、共培養時間和共培養溫度，設計實驗，確定橡膠樹連續繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉化的優化條件；

步驟三，以橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織在含有一定Kan濃度梯度的繼代增殖培養基中的生長速率為指標，測定熱研88-13易碎胚性愈傷組織對Kan敏感濃度為100～125mg/L，用于抗性愈傷組織的篩選；

步驟四，抗性愈傷組織、胚狀體和再生植株的獲得，共培養結束后，將熱研88-13易碎胚性愈傷組織轉入抑菌培養基中進行抑菌處理，18天后，轉移到卡那霉素為100～125mg/L的篩選培養基中，經過4個月的篩選，長出鮮黃色的抗性愈傷組織，把經過GUS染色為陽性的愈傷組織增殖1～2個月后誘導胚狀體和植株再生，結果從熱研88-13獲得了5個抗性易碎胚性愈傷組織系，從抗性愈傷組織共誘導出了843個胚狀體，21株擬轉化植株；