[發明專利]一種轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法

在審

• 申請號: 201410267627.3
• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN104031936A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 李哲;畢政鴻;戴雪梅;黃華孫;林位夫;周建南
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院橡膠研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法，其特征在于，該轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法包括：

步驟一，擬南芥AtWUS基因克隆和植物表達載體構建，克隆擬南芥AtWUS基因，構建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表達載體；

步驟二，根據β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)瞬時表達率的多少和細胞存活率的高低，結合影響根癌農桿菌遺傳轉化的相關因素，相關因素包括預培養時間、菌液濃度、乙酰丁香酮AS濃度、侵染時間、共培養時間和共培養溫度，設計實驗，確定橡膠樹連續繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉化的優化條件；

步驟三，以橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織在含有Kan濃度梯度的繼代增殖培養基中的生長速率為指標，測定熱研88-13易碎胚性愈傷組織對Kan敏感濃度為100～125mg/L，用于抗性愈傷組織的篩選；

步驟四，抗性愈傷組織、胚狀體和再生植株的獲得，共培養結束后，將熱研88-13易碎胚性愈傷組織轉入抑菌培養基中進行抑菌處理，18天后，轉移到卡那霉素為100～125mg/L的篩選培養基中，經過4個月的篩選，長出鮮黃色的抗性愈傷組織，把經過GUS染色為陽性的愈傷組織增殖1～2個月后誘導胚狀體和植株再生，結果從熱研88-13獲得了5個抗性易碎胚性愈傷組織系，從抗性愈傷組織共誘導出了843個胚狀體，21株擬轉化植株；

步驟五，組織化學檢測和分子檢測，切取14株熱研88-13抗性擬轉化植株的子葉進行GUS染色，結果有6株呈藍色陽性，并且陽性植株具有一定表型特征，選取7株熱研88-13抗性植株和3株對照一起進行分子檢測。

2.如權利要求1所述的轉AtWUS基因促進橡膠樹側芽發生的方法，其特征在于，步驟一具體包括：

稱取0.5克擬南芥新鮮葉片，提取擬南芥RNA，采用Transtart?II?First-strandcDNAsynthesissupermix試劑盒合成cDNA，根據NCBI中登錄號為NM_127349的AtWUS基因ORF設計一對特異引物，上游引物為WF:5‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物為WR：5‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物5‘端各加一個BamHI和SacI酶切位點；

以合成的AtWUScDNA為模版，WF、WR為特異引物，用聚合酶鏈式反應擴增AtWUS基因，PCR產物通過瓊脂糖凝膠1.0％電泳和凝膠成像系統的觀察，切下預期大小的目的片段，稱重，然后用Wizard?DNAClean-UpKit回收純化目的片段，用pEASY-T1CloningKit對目的片段進行TA克隆，16℃過夜連接，得到pEASY-T1克隆載體連接反應液；

制備大腸桿菌E.coliJM109感受態細胞，在冰上按照100μL/管分裝，取出1管大腸桿菌感受態細胞置于冰上，待溶解后加入5.0μlpEASY-T1克隆載體連接反應液，以轉化E.coliJM109感受態細胞；

挑選固體培養基上的幾個單菌落分別以WF和WR為引物，挑選的菌體為模板，2×EasyTaqPCRSuperMix進行PCR，對轉化重組子進行PCR檢測，提取大腸桿菌質粒DNA，用BamHI和SacI雙酶切，以鑒定菌落PCR陽性重組子，將PCR陽性克隆的菌液送往深圳華大基因公司進行測序檢測；

中間植物表達載體pCAMBIA2301-uidA的構建：分別用HindIII2.0μL和EcoRI2.0μL雙酶切pCAMBIA2301-MCS和pBI121-uidA兩載體，分別回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121-uidA小片段，將回收的兩片段用T4-DNAligase1.0μL連接，重組子進行雙酶切檢測；

植物表達載體pCAMBIA2301-AtWUS的構建：用BamHI和SacI分別雙酶切pCAMBIA2301-uidA和pEASY-T1-AtWUS；分別回收pCAMBIA2301-uidA大片段和pEASY-T1-AtWUS小片段；將回收的兩片段連接，在PCR管中完成連接反應，16℃水浴，連接過夜；將連接產物轉化大腸桿菌JM109；對重組子進行雙酶切檢測。