[發明專利]一種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法

有效

• 申請號: 201410266781.9
• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN103995123A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 秦愛建;王志明;丁家波;邵紅霞;錢琨;馮忠武
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所 32106
• 代理人: 江平

技術領域

本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及對牛、羊的布魯氏菌病的一種檢測技術領域。

背景技術

布魯氏菌病（布病）是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患病，反芻動物特別是牛和羊容易感染。根據抗原型和宿主類型將布魯氏菌分為6類，患病母畜一般癥狀是流產，雄性則引起不育等生殖障礙。近幾年在世界范圍內布病呈現出反彈的趨勢，在中國，牛種布魯氏菌(B.?abortus)和羊種布魯氏菌(B.melitensis)造成的危害尤為廣泛和嚴重，該病給畜牧業和公共衛生事業造成巨大經濟損失，加強對布病的防控具有重要的現實意義。

對布病進行準確診斷是防止該病蔓延的首要措施，常見的布病血清學診斷方法主要有凝集試驗、補體結合試驗(CFT)、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和熒光偏振試驗（FPA）。由于牛種布魯氏菌和某些桿菌（最主要的是小腸結腸炎耶爾森菌O9、大腸桿菌O157）在脂多糖鏈(LPS)上存在共同的抗原位點，一般認為這些抗原位點屬于脂多糖上可溶的蛋白類物質，因此血清學檢測中往往因為交叉反應的存在而造成假陽性結果。相對而言，凝集試驗的特異性和敏感性均較低，在一些發達國家已停止使用。CFT雖然特異性和敏感性均比較高，但由于操作繁瑣，不適合常規檢驗，更不適合高通量檢測，往往只用于確診或作為其它診斷方法的仲裁。利用單克隆抗體（Mab）建立的檢測動物血清中抗體的競爭ELISA（cELISA）方法已然成為目前檢測布病的可靠方法之一。

目前為止，已制備針對位于脂多糖O鏈上(O-LPS)的A抗原、M抗原、C抗原和C/Y抗原的單克隆抗體；另一方面，學者們發現某些特定的外膜蛋白也存在免疫原性，如OMP31等利用這些單克隆抗體建立的cELISA方法早已應用于對布病的血清學檢測，但由于不同單抗靈敏度和特異性等因素的限定，以及交叉反應的干擾，在實際檢測當中往往會出現漏檢、錯檢的結果。事實上，經本發明人研究發現，利用補體結合實驗（CFT）和已建立的cELISA方法在檢測臨床樣品時存在一定的不吻合率，特別是對一些介于陰性和陽性之間的疑似樣品的判定。

發明內容

本發明目的是提出一種能夠提高檢測準確性的競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法。

本發明的技術方案包括以下步驟：

1）將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標板；

2）將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標板的板孔中，37℃水浴1小時后，用PBST洗滌，再向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應；

3）測得各板孔的OD450值；

4）由公式100×（1-OD_陰性對照/OD_待檢樣品）%分別計算各板孔的抑制率；

其中，OD_陰性對照為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和已知的陰性血清的D₄₅₀值；OD_待檢樣品為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的OD₄₅₀值；

5）判定待檢血清樣品：抑制率≥30%，則判定待檢血清樣品為陽性。

本發明采用單克隆抗體Bru-5C10建立的cELISA通過軟件的ROC分析給出的最佳臨界值PI=25%，此時特異性為96.3%，敏感度為99.1%；為了提高檢測過程中的特異性，本發明選擇PI=30%作為臨界值，此時特異性為98.8%，?敏感度為96.2%。

本發明利用建立的cELISA方法對小腸結腸炎耶爾森菌O9和大腸桿菌O157高免陽性血清進行檢測，PI值均低于30%，說明本發明可以有效地排除假陽性結果的發生。

為了建立更準確的檢測布病的cELISA方法，本發明利用滅活的牛種布魯氏菌2308免疫小鼠，通過細胞融合技術獲得1株對牛種布魯氏菌有良好反應性的單克隆抗體，命名為單克隆抗體bru-5C10。本發明的單克隆抗體bru-5C10為雜交瘤細胞株?bru-5C10分泌獲得。

本發明的單克隆抗體bru-5C10，于2014年5月7日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號CGMCC?No.9219，

生物材料：Bru-5C10，分類命名：雜交瘤細胞株。