[發明專利]一種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法

有效

• 申請號: 201410266781.9
• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN103995123A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 秦愛建;王志明;丁家波;邵紅霞;錢琨;馮忠武
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所 32106
• 代理人: 江平

1.一種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標板；

2）將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標板的板孔中，37℃水浴后，用PBST洗滌，向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應；

3）測得各板孔的OD₄₅₀值；

4）由公式100×（1-OD_陰性對照/OD_待檢樣品）%分別計算各板孔的抑制率；

其中，OD_陰性對照為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和已知的陰性血清的板孔的OD₄₅₀值；OD_待檢樣品為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的OD₄₅₀值；

5）判定待檢血清樣品：抑制率≥30%，則判定待檢血清樣品為陽性。

2.根據權利要求1所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于單克隆抗體bru-5C10為雜交瘤細胞株?bru-5C10分泌獲得。

3.根據權利要求1所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99按1.75μg/孔溶于pH為9.6的碳酸鹽緩沖液中，100μl/孔加入酶標版中，4℃孵育12h，棄去酶標板中的液體后，用PBST配制的5%脫脂乳，100μl/孔加入酶標版中，封閉后于37℃放置，3h后棄去封閉液，再用PBST洗滌2次，即得包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標板。

4.根據權利要求1或2或3所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于所述超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99的方法是：用生理鹽水洗下在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基上生長的牛種布魯氏菌S2308，置于80℃水浴滅活2h后調節菌液濁度，使其濁度約為1×10¹⁰CFU/ml；然后以頻率為30H_Z的超聲裂解破碎菌體3～4次，15min/次。