[發(fā)明專利]一種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410263863.8
• 申請日: 2012-11-14
• 公開（公告）號: CN104109674A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李壽東;胡建紅;李戈強(qiáng);李朝君;謝志峰;李朝志
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西安仁欣生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/72
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 陸小盆

本申請是“一種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法”的分案申請，該原申請的申請日為2012年11月14日、申請?zhí)枮?012104568467、發(fā)明創(chuàng)造名稱“一種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法”。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和力的糖化血紅蛋白GHb的核酸適體及其制備方法。

背景技術(shù)

糖尿病是人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，糖尿病是一種終生性疾病，其并發(fā)癥是至殘至死的主要原因，所以人們希望能盡早發(fā)現(xiàn)和治療糖尿病。傳統(tǒng)的糖尿病診斷和治療監(jiān)測采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)等，但是血糖參數(shù)僅代表抽血時(shí)的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白(?GHb)作為反映長期血糖水平的金標(biāo)準(zhǔn)，也是監(jiān)測糖尿病治療的重要指標(biāo)。GHb是紅細(xì)胞中血紅蛋白與葡萄糖緩慢、持續(xù)且不可逆地進(jìn)行非酶促蛋白糖化反應(yīng)的產(chǎn)物。形成兩周后不易分開。當(dāng)血液中葡萄糖濃度較高時(shí)，人體所形成的GHb含量也會相對較高.?正常生理?xiàng)l件下，非酶促糖化反應(yīng)產(chǎn)物的生成量與反應(yīng)物的濃度成正比。由于蛋白質(zhì)濃度保持相對穩(wěn)定，糖化水平主要決定于葡萄糖濃度，也與蛋白質(zhì)與葡萄糖接觸的時(shí)間長短有關(guān)。GHb可以反映最近2~3個(gè)月的平均血糖水平。2002年美國糖尿病協(xié)會已明確規(guī)定應(yīng)定期檢測GHb，并將其作為監(jiān)測糖尿病血糖控制的金標(biāo)。普及糖尿病知識，更新治療理念，監(jiān)測并保持GHb達(dá)標(biāo)，更早、更合理地使用胰島素等藥物治療，對于控制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展尤為重要。

目前常用的糖化血紅蛋白的檢測方法有兩大類：高壓液相方法(HPLC)和免疫方法。高壓液相方法(HPLC)所使用的儀器昂貴，難以在比較基層的醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室普及；微柱法手工操作步驟繁瑣，層析時(shí)間和微柱的質(zhì)量不易控制，易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差，重復(fù)性欠佳；而且干擾因素很多，尤其對pH值和溫度的變化敏感，HbF及變異血紅蛋白(HbS、HbC、HbE等)對結(jié)果干擾，干擾程度根據(jù)柱的分離能力而定，且要仔細(xì)觀察圖譜，所以該法得不到普遍采用。免疫法測定糖化血紅蛋白其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有欠缺，測定受高濃度葡萄糖、高三酰甘油、高膽紅素等物質(zhì)的干擾，由于樣本的濁度會使光度計(jì)測定產(chǎn)生錯(cuò)誤。另外，抗體由動物免疫獲得，成本高且篩選周期長，批與批之間存在差異；抗體對溫度濕度敏感，易變性難保存等缺點(diǎn)，也得不到廣泛使用。

核酸適配體是近年發(fā)展起來的一類新型識別分子，近年來受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，大量針對重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來；各種基于核酸適配體的分析方法和技術(shù)已被報(bào)道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子,?國內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識體或核酸適配體等。SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機(jī)序列組成)文庫,通過施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過程),?并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù),?經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集,?獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子,?可以是RNA?也可以是DNA,?長度一般為25~60個(gè)核苷酸。

核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性,?使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景,?盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少,?但應(yīng)用適體檢測靶蛋白的研究卻不斷增多,?基于適體的檢測新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。專利CN201010580661.8，名稱為蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸適體及其制備方法，公布了蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸適體的序列特征，通過設(shè)計(jì)合成單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸庫、篩選目的寡核苷酸序列、流式分析鑒定等步驟制備出蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的核酸適體。專利CN201110148431.9和專利CN201110148603.2，公布了HCV?E1E2蛋白的和HCV?NS5A蛋白核酸適體及其衍生物、篩選方法和應(yīng)用，其中核苷酸適體衍生物包括取代后的RNA核酸適體、骨架改造后的衍生物、改造為肽核酸后的衍生物以及連接上放射性分子后的衍生物。專利?CN201210214996.7，公布了可用于檢測肌紅蛋白的核酸適體、篩選用微流控芯片及其篩選方法和應(yīng)用，公開了一種用前述微流控芯片篩選所述核酸適體的篩選方法，包括優(yōu)化核酸文庫、初篩、純化、循環(huán)幾個(gè)主要步驟，該發(fā)明的檢測方法具有高親和力和高特異性的優(yōu)點(diǎn)。

由上可知，核酸適體由于其獨(dú)特的化學(xué)抗體特性成為新一代針對特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測其特異性識別的靶分子物質(zhì)。但是目前基于核酸適體的針對于糖化血紅蛋白GHb的高效特異性識別研究還很缺乏，且針對于糖化血紅蛋白GHb的核酸適體及其篩選制備方法尚未見有報(bào)道。