[發明專利]一種糖化血紅蛋白的核酸適體及其制備方法

有效

• 申請號: 201410263863.8
• 申請日: 2012-11-14
• 公開（公告）號: CN104109674A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發明（設計）人: 李壽東;胡建紅;李戈強;李朝君;謝志峰;李朝志
• 申請（專利權）人: 廣西安仁欣生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/72
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 陸小盆

1.一種糖化血紅蛋白核酸適體，其特征在于，所述核酸適體的核苷酸序列為有SEQ?ID?NO:2中所示DNA片段序列，其序列為：

SEQ?ID?NO:2：gggaggcatg?tgatttaagg?cgcggcagat?gttggaaccc。

2.一種制備權利要求1任一所述糖化血紅蛋白核酸適體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）構建隨機序列寡核苷酸庫：人工合成單鏈DNA序列，構建庫容量為10⁵~10⁶的單鏈DNA隨機序列寡核苷酸庫，單鏈DNA隨機寡核苷酸庫包括的DNA序列為：

????5’-GACCATACCAGCTTATTCAATT-N_25~60-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3’

所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的DNA序列包括中間隨機序列N_25~60和兩端固定序列，所述中間隨機序列N_25~60為25~60個堿基的隨機序列，所述兩端固定序列為：5’-GACCATACCAGCTTATTCAATT，3’-CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述兩端固定序列為PCR擴增引物結合區；

（2）制備糖化血紅蛋白-微磁珠復合物：將有活化氨基的微磁珠與糖化血紅蛋白按照0.05~0.2ml:1mg的比例在偶聯緩沖液中混合，再加入100~200ul偶聯劑溶液，25oC反應條件下輕混20~30小時，使糖化血紅蛋白C末端共價連接到微磁珠上，在分離裝置中用清洗液洗滌得到糖化血紅蛋白-微磁珠復合物；

（3）初次篩選靶物質-核酸復合物：將2~5nmol單鏈DNA隨機序列寡核苷酸庫溶于結合緩沖液，進行加熱處理，單鏈DNA文庫與沒有結合糖化血紅蛋白的磁珠孵育后，收集不結合磁珠的DNA隨機寡核苷酸庫的液體；將步驟2）糖化血紅蛋白-微磁珠復合物與熱處理后收集不結合磁珠的DNA隨機寡核苷酸庫在結合緩沖液中37oC溫育15~40min，用洗脫緩沖液洗滌糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復合物，除去不與糖化血紅蛋白結合的和非特異結合的寡核苷酸序列，糖化血紅蛋白-寡核苷酸-微磁珠復合物在洗脫緩沖液中92oC孵育5min后，回收帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液；

（4）制備次級單鏈DNA寡核苷酸庫：將步驟3）中回收得到帶有單鏈寡核苷酸序列的洗脫緩沖液進行PCR擴增，PCR擴增產物以鏈霉親和素微磁珠為基質進行分離，經過堿變性解鏈，過濾，純化，獲得次級單鏈DNA寡核苷酸庫，用于下一輪篩選；

（5）篩選并鑒定糖化血紅蛋白核酸適體：將步驟4）所得的次級單鏈DNA寡核苷酸庫經過12~20輪鏈霉親和素微磁珠為基質分離篩選，獲得目標寡核酸序列，克隆并測序所述目標寡核酸序列,通過酶聯核酸適體吸附測定法鑒定其與糖化血紅蛋白結合的特異性和親和力。

3.根據權利要求2所述的一種制備糖化血紅蛋白核酸適體的方法，其特征在于：所述的PCR擴增用到的PCR引物序列為：

????引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

????引物2：5’-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’

所述的PCR擴增引物2的5’端含生物素標記；

所述PCR擴增工藝條件為：94oC預變性5?min，94oC?30s，47oC?1min，72oC?1min,?擴增10~25個循環，最終延伸反應為72oC?10min。

4.根據權利要求2所述的一種制備糖化血紅蛋白核酸適體的方法，所述的偶聯緩沖液為含20mM?磷酸鉀鹽緩沖液，0.15M?NaCl,?1mM?DTT,?pH?5.5；所述偶聯劑溶液為含57%的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；所述結合緩沖液為含100?mM?NaCl,?20?mM?Tris-HCl?pH?7.6,?2?mM?MgCl₂,?5mM?KCl,?1?mM?CaCl₂，0.02%?Tween?20,?1?mM?DTT；所述熱處理為90?oC加熱10min，置于冰上10min，然后溫度放置5min；所述洗脫緩沖液為含20?mM?Tris-HCl?pH7.6，200?mM?NaCl，10?mM?EDTA。