[發明專利]耐輻射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性啟動和提高方法

有效

• 申請號: 201410262937.6
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104212782A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 華躍進;王云光;王梁燕
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12R1/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術領域

本發明涉及一種新發現的耐輻射奇球菌蛋白酶PprI，涉及金屬離子對酶活性的啟動作用、基因啟動子對酶切效率的促進作用。

背景技術

蛋白酶是水解蛋白質肽鍵的一類酶的總稱，可以催化蛋白質中肽鍵的水解。蛋白酶廣泛存在于動物、植物和微生物中。到目前為止，國際市場上商品蛋白酶100種以上。由于動植物資源有限，工業上生產蛋白酶制劑主要來自微生物，利用枯草桿菌、酵母、霉菌、大腸桿菌等微生物提取制備。隨著蛋白酶研究的深入，它的工業應用越來越引起了人們的廣泛關注。

蛋白酶已廣泛應用在毛皮、皮革、絲綢、醫藥、食品、釀造、石油鉆井等領域。利用蛋白酶，皮革工業的脫毛軟化，既節省時間，又改善勞動衛生條件。蛋白酶還可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清。臨床上可作藥用，例如用于消化不良、支氣管炎、脈管炎等癥狀的治療。加入蛋白酶的洗衣粉能高效去除衣物上的血漬和蛋白污物。另外，蛋白酶廣泛應用于生化分子實驗，作為蛋白質的手術刀，是生命科學研究不可或缺的。

耐輻射奇球菌是一種極端環境微生物，以對電離輻射、紫外射線、干燥和氧化壓力等極端條件表現極強抗性而著稱。它的這種超強抗性有一部分歸功于其體內pprI基因（基因名dr_0167，NCBI-GeneID:?1798483）。它是在基因損傷修復中起整體調控作用。pprI基因表達的產物PprI蛋白（NCBI-GI:?15805204）由328個氨基酸組成，含3個功能結構域，分別是鋅指-蛋白酶結構域，螺旋-轉角-螺旋結構域，GAF結構域。但是至今為止，PprI的蛋白酶活性和酶底物從未被發現。

發明內容

本發明的目的是提供一種耐輻射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性啟動與提高方法。

耐輻射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性優化方法，所述的蛋白酶PprI的酶活性啟動需要Mn²⁺離子。

所述的Mn²⁺離子濃度為2.0-5.0?mM。

所述的蛋白酶PprI的反應緩沖液含100-200?mM?NaCl、10-50mM?Tris-HCl?8.0、1mM?DTT、2.0-5.0?mM?MnCl₂。

?所述的蛋白酶PprI酶活性的提高需要基因啟動子。

所述的基因啟動子為dr2340基因啟動子和dr2574基因啟動子。

本發明的有益效果：

????蛋白質的手術刀，是生命科學研究不可或缺的；本發明可以高效提高蛋白酶PprI的酶切活性，縮短反應時間。

附圖說明

圖1是不同金屬離子對蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE圖；

?其中，從左至右，分別是不加金屬離子的對照反應；加EDTA的對照反應；

加Ca²⁺的反應；加Cu²⁺的反應；加Fe²⁺的反應；加Mg²⁺的反應；加Ni²⁺的反應；

加Mn²⁺的反應；加Zn²⁺的反應。

圖2是ddrO基因啟動子促進蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE圖；

???其中，第1道為不加ddrO基因啟動子的對照實驗；第2到5道為ddrO基因啟動子的量遞增的反應，濃度范圍從0.04μM/L到0.32μM/L。

圖3是recA基因啟動子促進蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE圖。

其中，第1道為不加recA基因啟動子的對照實驗；第2到5道為recA基因啟動子的量遞增的反應，濃度范圍從0.04μM/L到0.32μM/L。

?圖4是非特異性DNA處理對照實驗的SDS-PAGE圖；

???其中，第1道為不加啟動子的對照實驗；第2道為加非特異性DNA的對照實

驗，濃度為0.32μM/L。

具體實施方式