[發(fā)明專利]肝癌相關(guān)的亮氨酸富集不育阿爾法模體1基因甲基化位點(diǎn)及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410262915.X
• 申請(qǐng)日: 2014-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN104250664A
• 公開（公告）日: 2014-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊小麗;何敏;劉坤;張成東;張悅寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 楊小麗
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 45106
• 代理人: 黎明天

技術(shù)領(lǐng)域

本研究涉及亮氨酸富集不育阿爾法模體1?(?leucine?rich?repeat?and?sterile?alpha?motif?containing?1,?LRSAM1)?基因特異性DNA（脫氧核糖核酸）甲基化位點(diǎn)在肝癌中的甲基化定量信息的改變，具體的說是應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)LRSAM1?基因特異性DNA甲基化位點(diǎn)（cg05840553）在肝癌中甲基化程度減少，為了解肝癌的發(fā)病機(jī)理，尋找到有潛在臨床意義的腫瘤預(yù)防及治療靶點(diǎn)提供支持。?

背景技術(shù)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥“殺手”。目前對(duì)肝癌的治療主要以手術(shù)、放化療為主，同時(shí)結(jié)合其它治療方法，如免疫治療、中醫(yī)等；但由于對(duì)于肝癌的發(fā)病機(jī)制不太清楚及缺乏有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于中后期的病人治療效果不佳。研究表明，肝癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)表觀遺傳學(xué)調(diào)控的過程。DNA甲基化是目前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，它是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA?methyltransferase，DNMT)介導(dǎo)下，以S-腺苷蛋氨酸為甲基供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA某些堿基上的過程。DNA甲基化異常被認(rèn)為是發(fā)生腫瘤（包括肝癌）的一個(gè)重要原因。?研究肝癌相關(guān)基因特異性位點(diǎn)甲基化的改變，有助于了解肝癌的發(fā)病機(jī)理，為肝癌的預(yù)防和治療提供有效的作用靶點(diǎn)。?

????LRSAM1基因編碼一個(gè)指環(huán)狀的蛋白，該蛋白參與多種重要的生物學(xué)功能，包括信號(hào)通路調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附、泛素化、細(xì)胞內(nèi)吞作用等。LRSAM基因異常，與部分腫瘤具有相關(guān)性。LRSAM特異性DNA位點(diǎn)甲基化與肝癌的關(guān)系目前國內(nèi)外未見研究報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種焦磷酸測(cè)序法定量檢測(cè)人LRSAM1基因特異性位點(diǎn)的甲基化水平及特異性引物，利用該引物可以準(zhǔn)確檢測(cè)人原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中特異性DNA位點(diǎn)的甲基化水平。?

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容是：?

1．??肝癌相關(guān)的亮氨酸富集不育阿爾法模體1?(?leucine?rich?repeat?and?sterile?alpha?motif?containing?1,?LRSAM1)??基因甲基化位點(diǎn)，其特征在于：甲基化芯片篩查原發(fā)性肝細(xì)胞癌與對(duì)應(yīng)的癌旁組織中甲基化譜之間的差異，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的DNA中，LRSAM1基因的一個(gè)位點(diǎn)cg05840553的甲基化水平明顯低于癌旁組，差異具有顯著性，該特異性位點(diǎn)所在的核酸序列為?：GGCATGAGACACAGCCTGCCACATTAACTGCTAGGTTTACATCTACAACACAGCTGGAAACGCTCACTGGATCTTCACCCACACCCCGTTTAATCTCCCAACAACGCCATGCCCACTTCCTG?，下劃線處堿基為該甲基化位點(diǎn)?的確切位置，該位點(diǎn)距LRSAM1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)1157個(gè)堿基。

2．??肝癌相關(guān)的LRSAM1?基因甲基化位點(diǎn)的應(yīng)用，其特征在于：焦磷酸測(cè)序法定量檢測(cè)人LRSAM1基因特異性甲基化位點(diǎn)cg05840553,特異性甲基化位點(diǎn)的引物，包括PCR引物和甲基化測(cè)序引物，其中，所述PCR上游引物序列為：5^’-GGGAAGTTAGTAGTTGTTTAGTAGGTATG-3^，，下游引物序列為：biotin-5^，-ACTTAAAAACATTAAACAACCAACATCTA-3^，，甲基化測(cè)序引物序列為：5^，-ATATTTATAATATAGTTGGAA-3^，；利用該引物可以準(zhǔn)確檢測(cè)人原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中特異性DNA位點(diǎn)的甲基化水平。?

3.?所述肝癌相關(guān)的LRSAM1?基因甲基化位點(diǎn)的應(yīng)用，其特征在于：應(yīng)用焦磷酸測(cè)序?qū)RSAM1?基因cg05840553位點(diǎn)甲基化程度檢測(cè)中，原發(fā)性肝細(xì)胞癌與對(duì)應(yīng)的癌旁組織存在顯著性差異；cg05840553在肝癌中甲基化程度顯著降低；通過焦磷酸測(cè)序能對(duì)該特異性位點(diǎn)的甲基化進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，為肝癌的預(yù)防和治療提供有效的作用靶點(diǎn)。?

本發(fā)明利用?Infinium?HumanMethylation27?BeadChip?甲基化芯片篩查原發(fā)性肝細(xì)胞癌與對(duì)應(yīng)的癌旁組織中甲基化譜之間的差異，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的基因組DNA中，LRSAM1基因啟動(dòng)子區(qū)一個(gè)位點(diǎn)（該位點(diǎn)在上述甲基化芯片中的編號(hào)為：cg05840553）的甲基化水平明顯低于癌旁組。?