[發明專利]人體細胞因子的表達、純化和復性方式

在審

• 申請號: 201410262846.2
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104004766A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 張進平
• 申請（專利權）人: 蘇州景美生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/25
• 分類號: C12N15/25;C12N15/70;C07K14/545
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種人體細胞因子的表達、純化和復性方式。

背景技術

IL-1是一類小分子的細胞因子多肽，主要有IL-1alpha和IL-1beta兩種亞型。IL-1主要由活化的巨噬細胞產生，此外在幾乎所有有核細胞如B細胞、NK細胞、T細胞、樹突狀細胞等細胞中均可產生。兩種不同亞型IL-1可以以同樣的親和力與其受體結合，發揮同樣的生物學功能。IL-1功能廣泛：可以與抗原協同作用使CD4+T細胞發生活化；促進B細胞生長和分化；促進單核巨噬細胞的抗原遞呈能力；與IL-2或IFNγ協同作用增強NK細胞活性等。在目前腫瘤細胞免疫治療中，使用IL-1beta和IFNγ及IL-2等共同刺激NK的活性，從而達到治療腫瘤作用，因此大量制備IL-1beta成為市場的巨大需求，但通常的市售的IL-1beta產品存在很多不盡如人意的技術問題，如產量低，由于細胞因子在制備過程中往往碰到復性困難而使細胞因子活性受到極大的影響。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種人體細胞因子的表達、純化和復性方式，通過將人的IL-1beta基因插入到帶GST的表達載體pGEx-4T-1中，在大腸桿菌中表達IL-1beta，并通過低溫凍存法將包涵體大量釋放，進而采用連續梯度法透析，一方面能大量制備IL-1beta，同時又能使IL-1beta很好的復性。

本發明的技術方案如下：

人體細胞因子的表達、純化和復性方式，主要包括以下步驟：

（1）根據基因序列表查找人IL-1beta的cDNA序列（IL1βaccession?number?NM_000576.2）并設計PCR引物：

Forward?Primer???5’?CGGGATCCGCACCTGTACGATCACTGAAC?3’?(BamHI)

Reverse?Primer??5’?CCGCTCGAGTGGGTACAGCTCTCTTTAGG?3’?(Xho?I)；（2）運用pfu多聚酶進行PCR，并將PCR產物運用BamHI和XhoI進行酶切，同時用相同酶對pGEx-4T-1進行酶切。將酶切產物回收后用T4連接酶連接，所述PCR的反應體系由下列物質組成：5ul?的10×Pfu?Buffer?with?MgSO4?；5ul的d?NTPmix,2mM?each；2ul的Forward?Primer；2ul的Reverse?Primer；5ul的Template?DNA和1?ul的Pfu?DNA?polymerase；在對pfu多聚酶進行PCR的過程中，按照以下方式進行：首先在95℃的條件下進行3min的預變性，在95℃的條件下進行30s的變性處理，然后在58℃的條件下進行30s的退火處理，同時在72℃的條件下進行2min的延伸，如此進行30個循環過程，然后保存于4℃的環境中；（3）將連接好的質粒用熱刺激法轉化到感受態BL21，并涂在氨芐板中；（4）撬取陽性克隆，進行菌落PCR鑒定和測序鑒定。并將鑒定為陽性的菌落保存；（5）接種步驟（4）中的陽性菌落與LB培養基中，并用IPTG誘導過夜，放置于溫度為25?oC，轉速為250rpm的環境中；（6）收集步驟（5）中的細菌5000g，在溫度為4℃的環境中，離心20min；（7）去上清后用PBS洗兩次，然后將沉淀放置于-80℃過夜，過夜后取出，放置室溫融化；（8）加入含溶菌酶的裂解液，所述裂解液的濃度為0.1mg/ml，室溫裂解2h；（9）利用超聲進一步裂解細菌，所述裂解方式為：超聲5s，然后間隔5s，共計30min，超聲后經12000g，在4℃的環境中離心15min；（10）用含detergen的緩沖液洗滌包涵體3-4次直到蛋白變白；（11）用含2M尿素的緩沖液B重懸包涵體，將包涵體凍存在-20℃的環境中?，2-3h后取出融化，離心，上清中即為所需蛋白；（12）將蛋白放置透析袋中，透析袋放在含2M尿素的裂解液中，逐滴加入不含尿素的緩沖液，同時用蠕動泵將燒杯中緩沖液吸出，過夜透析，直到吸入和排出的緩沖液為初始雙倍體積，體積約為4L，再用GST純化柱的binding緩沖液繼續透析過夜，然后將透析袋內的液體吸出，按照GST純化試劑的步驟進行純化；（13）將純化的GST-IL-1beta融合蛋白用凝血酶切割，切割后的蛋白再行GST純化，收集流出的蛋白，此時所述蛋白含有IL-1beta和凝血酶，將IL-1beta和凝血酶經過sephadex?分離，收集IL-1beta端，即為純化的IL-1beta。