[發(fā)明專利]人體細(xì)胞因子的表達(dá)、純化和復(fù)性方式

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410262846.2
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104004766A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張進(jìn)平
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州景美生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/25
• 分類號: C12N15/25;C12N15/70;C07K14/545
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1.人體細(xì)胞因子的表達(dá)、純化和復(fù)性方式，主要包括以下步驟：

（1）根據(jù)基因序列表查找人IL-1beta的cDNA序列（IL1βaccession?number?NM_000576.2）并設(shè)計(jì)PCR引物：

（2）運(yùn)用pfu多聚酶進(jìn)行PCR，并將PCR產(chǎn)物運(yùn)用BamHI和XhoI進(jìn)行酶切，同時用相同酶對pGEx-4T-1進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物回收后用T4連接酶連接，所述PCR的反應(yīng)體系由下列物質(zhì)組成：?5ul?的10×Pfu?Buffer?with?MgSO4?；5ul的d?NTPmix,2mM?each；2ul的Forward?Primer；2ul的Reverse?Primer；5ul的Template?DNA和1?ul的Pfu?DNA?polymerase；在對pfu多聚酶進(jìn)行PCR的過程中，按照以下方式進(jìn)行：首先在95℃的條件下進(jìn)行3min的預(yù)變性，在95℃的條件下進(jìn)行30s的變性處理，然后在58℃的條件下進(jìn)行30s的退火處理，同時在72℃的條件下進(jìn)行2min的延伸，如此進(jìn)行30個循環(huán)過程，然后保存于4℃的環(huán)境中；

（3）將連接好的質(zhì)粒用熱刺激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21，并涂在氨芐板中；

（4）撬取陽性克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定和測序鑒定，并將鑒定為陽性的菌落保存；

（5）接種步驟（4）中的陽性菌落與LB培養(yǎng)基中，并用IPTG誘導(dǎo)過夜，放置于溫度為25?oC，轉(zhuǎn)速為250rpm的環(huán)境中；

（6）收集步驟（5）中的細(xì)菌5000g，在溫度為4℃的環(huán)境中，離心20min；

（7）去上清后用PBS洗兩次，然后將沉淀放置于-80℃過夜，過夜后取出，放置室溫融化；

（8）加入含溶菌酶的裂解液，所述裂解液的濃度為0.1mg/ml，室溫裂解2h；

（9）利用超聲進(jìn)一步裂解細(xì)菌，所述裂解方式為：超聲5s，然后間隔5s，共計(jì)30min，超聲后經(jīng)12000g，在4℃的環(huán)境中離心15min；

（10）用含detergen的緩沖液洗滌包涵體3-4次直到蛋白變白；?

（11）用含2M尿素的緩沖液B重懸包涵體，將包涵體凍存在-20℃的環(huán)境中?，2-3h后取出融化，離心，上清中即為所需蛋白；

（12）將蛋白放置透析袋中，透析袋放在含2M尿素的裂解液中，逐滴加入不含尿素的緩沖液，同時用蠕動泵將燒杯中緩沖液吸出，過夜透析，直到吸入和排出的緩沖液為初始雙倍體積，體積約為4L，再用GST純化柱的binding緩沖液繼續(xù)透析過夜，然后將透析袋內(nèi)的液體吸出，按照GST純化試劑的步驟進(jìn)行純化；

（13）將純化的GST-IL-1beta融合蛋白用凝血酶切割，切割后的蛋白再行GST純化，收集流出的蛋白，此時所述蛋白含有IL-1beta和凝血酶，將IL-1beta和凝血酶經(jīng)過sephadex?分離，收集IL-1beta端，即為純化的IL-1beta。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體細(xì)胞因子的表達(dá)、純化和復(fù)性方式，其特征在于，所述detergen的緩沖液由下列物質(zhì)組成：50mM?Tris-HCl?pH?8.0，100Mm?NaCl，1mM?EDTA，1%?Triton?X-100，1M?urea。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體細(xì)胞因子的表達(dá)、純化和復(fù)性方式，其特征在于，所述緩沖液B由下列物質(zhì)組成：100mM?NaH2PO4，10mM?Tris.Cl，2M?尿素。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人體細(xì)胞因子的表達(dá)、純化和復(fù)性方式，其特征在于，所述緩沖液B中各物質(zhì)的比例如下：采用13.8g?NaH2PO4.H2O?，其分子量為137.99g/mol；采用1.2g?Tris?Base，其分子量為121.1g/mol，使用120-125g，分子量為60.06g/mol，且以上物質(zhì)中所含有的NaOH的PH值為8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體細(xì)胞因子的表達(dá)、純化和復(fù)性方式，其特征在于，所述PCR引物為：

Forward?Primer???5’?CGGGATCCGCACCTGTACGATCACTGAAC?3’?(BamHI)

Reverse?Primer???5’?CCGCTCGAGTGGGTACAGCTCTCTTTAGG?3’(Xho?I)。