[發明專利]特異響應逆境信號的nfiS基因的用途及其使用方法

有效

• 申請號: 201410262604.3
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104046635B
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 燕永亮;戰崳華;鄧志平;陸偉;林敏;張新雄;王亞君
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所;東莞市保得生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N1/21;C12N15/63;C12R1/38;C12R1/19
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙)11367
• 代理人: 孫海波

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種特異響應外界脅迫抗性的nfiS基因的用途及其使用方法。

背景技術

非編碼RNAs（non-coding RNAs, ncRNAs）是一類非常重要的調節子，此類調節子能夠使細胞調節它們的生理特性而適應環境的改變。已有的研究表明ncRNAs在細菌的蔗糖代謝、細胞外膜應激反應、群體感應和細菌毒力等方面發揮了重要的調節作用，其調控模式已經成為細菌調控網絡中的重要“分支”。

生物固氮是固氮微生物的一種特殊的生理功能，已知具固氮作用的微生物約近50個屬，包括細菌、放線菌和藍細菌（即藍藻），它們在生活方式、固氮作用類型等發面都有著較大區別。由于固氮條件本身是一個對碳、氮和氧要求較為嚴格的脅迫環境，而固氮微生物中開展非編碼RNA功能研究的報道不多，因此非編碼RNA在固氮微生物環境適應性方面發揮著怎樣的作用目前仍未知。

固氮施氏假單胞菌的非編碼RNA nfiS序列（基因序列為SEQ ID NO:1）中，沒有起始密碼子和終止密碼子，現有技術中沒有發現其能轉錄成非編碼RNA，也沒有其用途方面的相關報道。

發明內容

本發明提供一種特異響應抗性的nfiS基因的用途及其使用方法。發明人在進行施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）基因組研究過程中，首次發現了nfiS基因為可轉錄的有功能性的非編碼RNA基因，并發現該基因可用于提高菌株氧化脅迫抗性和鹽脅迫抗性，為獲得具有高效固氮活性和脅迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理論基礎。

本發明中，所述nfiS基因即為參與固氮施氏假單胞菌脅迫應答反應的非編碼RNA基因，其是經核苷酸序列為SEQ ID NO:1的DNA轉錄而成的非編碼RNA基因。

一種特異響應逆境信號的nfiS基因的用途，所述nfiS基因用于提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性。

上述方案優選的是，所述nfiS基因是經核苷酸序列為SEQ ID NO:1的DNA轉錄而成的非編碼RNA基因。

上述任一方案優選的是，所述菌株為固氮施氏假單胞菌或大腸桿菌及其衍生菌株。

一種利用nfiS基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方法，包括克隆完整的nfiS基因的DNA片段序列和構建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株的步驟。

上述任一方案優選的是，所述nfiS基因是經核苷酸序列為SEQ ID NO:1的DNA轉錄而成的非編碼RNA基因。

上述任一方案優選的是，所述克隆完整的nfiS基因的DNA序列包括從施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）基因組中通過PCR擴增出完整的nfiS基因的DNA片段序列。

上述任一方案優選的是，所述構建具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株的步驟為：

（1）將克隆出的完整的nfiS基因的DNA片段序列進行酶切；

（2）將酶切后的nfiS基因的DNA片段序列插入到表達載體的多克隆位點處；

（3）將步驟（2）中的載體通過熱激轉化的方法轉化到菌株中，構建重組表達菌株，即具有氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的重組菌株。

上述任一方案優選的是，所述酶切是用BamHI和HindIII酶進行雙酶切。

上述任一方案優選的是，所述表達載體是pLAFR3載體。

上述任一方案優選的是，所述菌株為固氮施氏假單胞菌或大腸桿菌及其衍生菌株。

上述任一方案優選的是，在步驟（2）中，還包括在表達載體的多克隆位點處插入驗證基因。

上述任一方案優選的是，包含所述驗證基因的表達載體為四環素抗性。

一種通過利用nfiS基因提高菌株氧化脅迫抗性和/或鹽脅迫抗性的方法構建的重組菌株。

本發明中未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規技術條件。

本發明所述的特異響應逆境信號的nfiS基因的發明途徑為：

1、非編碼RNA對特異信號的響應體外表達分析表明nfiS基因能夠特異的響應氧脅迫信號。