[發明專利]一種全細胞催化產乳果糖的方法

在審

• 申請號: 201410262301.1
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104004699A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 楊瑞金;汪明明;華霄;張文斌;沈秋云
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/90;C12P19/24;C12P19/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種全細胞催化產乳果糖的方法，屬于食品生物技術領域。

背景技術

近年來，肥胖、糖尿病和心血管疾病人群呈現逐年增加和低齡化的趨勢，使得低熱量、具有更多功能特性的功能性甜味劑成為廣大食品從業者研發和關注的焦點。世界上有70％的人具有乳糖不耐癥，食用乳糖后會引起嚴重的胃腸道問題，每年世界上有幾百萬噸的乳糖因得不到進一步利用而被白白浪費同時引起環境污染，如何高效地利用乳糖成為急需解決的難題。而通過乳糖異構化得到的乳果糖以其優越的功能特性正成為廣大消費者和食品從業者關注的新熱點。

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)為乳糖異構化產物，是一種人工合成的且不能被人體消化吸收的功能性低聚糖。1957年奧地利學者Petuely發現，通過添加乳果糖，可使人工哺喂的嬰兒腸道菌群與母乳哺喂的嬰兒相接近，首次證實了乳果糖是一種雙歧桿菌增殖因子。在日本，乳果糖被認定為“特定保健用食品”添加劑而得以廣泛使用。目前在世界范圍內，乳果糖被廣泛應用于醫藥、保健、食品添加劑以及動物飼料等行業。在臨床醫藥行業，乳果糖主要用于治療肝性腦病、便秘、內毒素以及降血糖、降膽固醇等，在食品行業中被廣泛添加到嬰幼兒奶粉、軟飲料以及保健品中，主要是發揮其雙歧桿菌增殖因子的作用。

目前全球每年乳果糖的產量已超過60000噸，國內乳果糖生產企業僅有大連化工研究設計院、丹東康復制藥有限公司等少數企業，產品為低純度乳果糖糖漿，國內藥用級高純乳果糖幾乎全部依賴進口。且國內工業化生產均依靠化學法，酶法生產乳果糖還未實現產業化。化學法生產乳果糖具有轉化率高、可實現大規模生產等優點，但是化學異構化法的缺點也很突出，如反應副產物多、脫鹽操作復雜、能耗高以及存在安全隱患問題等。為了克服化學異構法存在的各種弊端，生物酶法轉化乳糖制備乳果糖因其制備的產物單一，天然無毒，符合廣大消費者追求天然產品的消費心理而成為目前的研究熱點。

目前用于生產乳果糖的酶主要有β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶以及來源于Caldicellulosiruptor?saccharolyticus的纖維二糖差向異構酶。其中β-糖苷酶以及β-半乳糖苷酶的轉化率比較低(7.5-30％)，得其不適合乳果糖的工業化生產。使用纖維二糖差向異構酶的純酶進行乳果糖的酶法生產時，在反應體系中需添加大量硼酸，硼酸是一種對人體有害的物質，脫除硼酸需要采用膜分離技術結合昂貴的脫硼樹脂，這會增大乳果糖工業生產的成本，同時帶來食品安全隱患。

如何有效避免上述問題而實現乳果糖的高效酶法生產必將成為食品工業從業者面臨的新任務。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一株異源表達纖維二糖差向異構酶的基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主、以pET-28a(+)為表達載體，表達核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的纖維二糖差向異構酶。

所述大腸桿菌優選E.coli?BL21(DE3)。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種誘導所述基因工程菌表達纖維二糖差向異構酶的方法，是利用IPTG或乳糖誘導重組E.coli?BL21(DE3)發酵產纖維二糖差向異構酶。

所述方法優選以構建好的產纖維二糖差向異構酶的重組大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)作為生產菌株，經活化、擴大培養至對數期OD₆₀₀＝0.2-2.0時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.05-1.2mM或者加入乳糖至終濃度為0.5-50g/L，15-45℃，150-250r/min搖床培養8-24h，離心收集菌體。

本發明要解決的第三個技術問題是提供一種利用所述基因工程菌全細胞催化生產乳果糖的方法，主要包括以下步驟：(1)以乳糖誘導培養重組E.coli?BL21(DE3)產纖維二糖差向異構酶；(2)收集培養得到的菌體通過乙醇透化、真空冷凍干燥處理作為細胞生物催化劑；(3)將細胞生物催化劑直接用于轉化乳糖生產乳果糖。

所述步驟(2)優選將1L發酵液中離心收集到的菌體懸浮于1-100mL1-90％(v/v)的乙醇中，4-30℃下混勻5-120min進行透化處理，離心收集沉淀，經真空冷凍干燥得到的菌粉4℃條件下保存，菌粉作為細胞生物催化劑直接用于轉化乳糖生產乳果糖。用乳糖誘導的全細胞透化后的酶活為300-400U/g。

所述透化處理時優選40％(v/v)乙醇。

所述步驟(3)優選以下步驟：