[發明專利]一種全細胞催化產乳果糖的方法

在審

• 申請號: 201410262301.1
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104004699A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 楊瑞金;汪明明;華霄;張文斌;沈秋云
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/90;C12P19/24;C12P19/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一株異源表達纖維二糖差向異構酶的基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的纖維二糖差向異構酶。

2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌是E.coli?BL21(DE3)，以pET-28a(+)為表達載體。

3.一種誘導權利要求1所述基因工程菌表達纖維二糖差向異構酶的方法，是利用IPTG或乳糖誘導重組大腸桿菌發酵產纖維二糖差向異構酶。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，以構建好的產纖維二糖差向異構酶的重組大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)作為生產菌株，經活化、擴大培養至對數期OD₆₀₀＝0.2-2.0時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度0.05-1.2mM或者加入乳糖至終濃度為0.5-50g/L，15-45℃，150-250r/min搖床培養8-24h，離心收集菌體，獲得表達了纖維二糖差向異構酶的重組大腸桿菌。

5.一種應用權利要求1所述基因工程菌全細胞催化產乳果糖的方法，其特征在于，主要包括以下步驟：(1)以乳糖誘導培養重組E.coli?BL21(DE3)產纖維二糖差向異構酶；(2)收集培養得到的菌體通過乙醇透化、真空冷凍干燥處理作為細胞生物催化劑；(3)將細胞生物催化劑直接用于轉化乳糖生產乳果糖。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)將1L發酵液中離心收集到的菌體懸浮于1-100mL1-90％的乙醇中，4-30℃下混勻5-120min，離心收集沉淀，經真空冷凍干燥得到的菌粉4℃條件下保存，菌粉作為細胞生物催化劑直接用于轉化乳糖生產乳果糖。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括以下步驟：

①將乳糖以緩沖液配制成50-800g/L，調節pH至6.0-9.5作為底物溶液；

②將細胞生物催化劑加入底物溶液，轉化條件為：底物乳糖濃度50-800g/L，生物催化劑以凍干菌粉的酶活計對底物溶液的用量為1-100U/mL，初始pH6.0-10.0，反應溫度為40-95℃，反應時間為1-24h。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，底物溶液是以Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、PIPES緩沖液、Na₂HPO₄-檸檬酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、Britton-Robinson緩沖液或水中的一種作為溶劑。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)在Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、PIPES緩沖液、Na₂HPO₄-檸檬酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、Britton-Robinson緩沖液或水中進行。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，底物乳糖濃度為600g/L，菌粉添加量為12.5U/mL，反應溫度為80℃，反應時間3h，pH7.5。