[發明專利]miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法

有效

• 申請號: 201410261531.6
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104513852A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 劉建明;周友浪;馬利林;王志偉
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙) 11316
• 代理人: 滑春生

技術領域

本發明涉及一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法。

背景技術

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌。近十幾年來，由于內鏡技術的發展與普及，早期胃癌檢出率得到提高，胃癌死亡率有所下降，但進展期胃癌的預后仍然很差，5年生存率僅為20-25%，中位生存期約24個月。外科手術仍是胃癌標準的治療方法，但治療結果并不令人滿意，即使是R0切除，其復發率仍然高達70%，術后放化療或圍手術期化療也只能降低10%-15%的復發風險。

長期以來，人們一直認為，腫瘤組織由各種異質化的腫瘤細胞組成，這些細胞都具有無限增殖和形成腫瘤的能力。近來研究結果表明腫瘤干細胞（cancer?stem?cells，CSCs）是腫瘤的根源，它決定腫瘤的發生、進展、放化療抵抗以及復發轉移，因此，只有針對腫瘤干細胞的治療才能為最終根治腫瘤帶來希望。目前，各種實體腫瘤中已相繼成功分離出了腫瘤干細胞，這些腫瘤有乳癌、腦癌、前列腺癌、黑色素瘤、結腸癌、肝癌、胰腺癌、頭頸部癌等。2009年Takaishi?S等采用流式細胞儀分選法（FACS）在含CD44+細胞的胃癌細胞株中成功分離出胃癌干細胞，2011年Song?Z等采用懸浮球培養法（tumorsphere?culturing）在胃癌細胞株及人胃癌新鮮標本組織中成功培養出懸浮球，這些懸浮球細胞類似于胃癌干細胞（cancer?stem-like?cells，CSLCs）。

然而，腫瘤干細胞本身在分子水平確切的調控機制尚不清楚。

microRNAs（miRNAs,?miRs)是一類專門調控基因表達的高度保守的的非編碼小分子RNA,?含?21?–?25個核苷酸,?通過與3'-非編碼區(3'UTR)?不完全結合誘導mRNA降解或抑制其轉錄?。miRNAs雖然小但卻廣泛參與細胞的發生、增殖及凋亡等生物學調控過程。早期研究發現miRNAs參與調控胚胎干細胞(ESC)的自我更新和分化,?最近的研究顯示miRNAs在調控腫瘤干細胞的生物學特性與功能方面發揮重要作用。Yu?F等研究乳腺癌干細胞?miRNAs表達譜發現let-7在乳腺癌干細胞表達明顯下調；進一步研究發現let-7調節干細胞的自我更新與分化，?let-7a過表達會抑制乳腺癌干細胞增殖、微球體形成、腫瘤的形成與轉移。Liu?C等研究發現前列腺癌干細胞miRNAs表達譜顯示miR-34a及let-7b表達下調，miR-34a過表達能明顯抑制前列腺癌的生長與轉移。

然而有關miRNAs與胃癌干細胞的研究報道極為罕見，miRNAs在胃癌干細胞中的表達譜尚未有相關報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有研究領域中的不足，提供一種?miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，推動miRNAs在胃癌干細胞方面的研究。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案實現：一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，包括以下步驟：

（1）胃癌干細胞的分離鑒定：選取三種或三種以上胃癌細胞株，采用懸浮球培養法分離出球體細胞；收集球體細胞與親代貼壁細胞，檢測干性基因CD44、Sox2、Oct3/4和Nanog表達，檢測化療耐受性及裸鼠成瘤能力；

（2）胃癌干細胞miRNAs表達譜分析及靶基因預測：收集懸浮球體細胞與親代貼壁細胞，基因芯片分析懸浮球體細胞與親代貼壁細胞的miRNAs的差異表達譜；PCR進一步檢測驗證球體細胞與親代貼壁細胞差異表達的miRNAs；采用生物信息學技術預測靶基因，并分析其生物學功能。

進一步的，所述步驟（1）具體包括以下步驟：

①選取至少三株胃癌細胞株分別進行培養；

②收集貼壁細胞置于含無血清的RPMI-1640培養液96孔超低粘附板中培養，培養液中含濃度1%?N-2?添加劑，濃度2%?B-27?添加劑，濃度為1%?青鏈霉素，20?ng/ml?成纖維細胞生長因子2（FGF-2）和100?ng/ml?表皮生長因子（EGF），觀察懸浮球形成球體的情況；

③第一代球體細胞培養到二周，將球體細胞吹散，重新置于RPMI-1640培養液96孔超低粘附板中培養，二周以后觀察球體形成情況；重復上述方法連續培養并傳代6代以上，提取球體細胞；

④將收集的球體細胞分成三份，通過球體細胞干性基因的檢測、裸鼠活體致瘤實驗和化療抵抗試驗測定其干細胞特性。

進一步的，所述步驟（1）的①中選取的胃癌細胞株為MKN-45、BGC823、NCI-N87以及SGC7901。