[發明專利]miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法

有效

• 申請號: 201410261531.6
• 申請日: 2014-06-13
• 公開（公告）號: CN104513852A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 劉建明;周友浪;馬利林;王志偉
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙) 11316
• 代理人: 滑春生

1.?一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）胃癌干細胞的分離鑒定：選取三種或三種以上胃癌細胞株，采用懸浮球培養法分離出球體細胞；收集球體細胞與親代貼壁細胞，檢測干性基因CD44、Sox2、Oct3/4和Nanog表達，檢測化療耐受性及裸鼠成瘤能力；

（2）胃癌干細胞miRNAs表達譜分析及靶基因預測：收集懸浮球體細胞與親代貼壁細胞，基因芯片分析懸浮球體細胞與親代貼壁細胞的miRNAs的差異表達譜；PCR進一步檢測驗證球體細胞與親代貼壁細胞差異表達的miRNAs；采用生物信息學技術預測靶基因，并分析其生物學功能。

2.根據權利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，其特征在于，所述步驟（1）具體包括以下步驟：

①選取至少三株胃癌細胞株分別進行培養；

②收集貼壁細胞置于含無血清的RPMI-1640培養液96孔超低粘附板中培養，培養液中含濃度1%?N-2?添加劑，濃度2%?B-27?添加劑，濃度為1%?青鏈霉素，20?ng/ml?成纖維細胞生長因子2（FGF-2）和100?ng/ml?表皮生長因子（EGF），觀察懸浮球形成球體的情況；

③第一代球體細胞培養到二周，將球體細胞吹散，重新置于RPMI-1640培養液96孔超低粘附板中培養，二周以后觀察球體形成情況；重復上述方法連續培養并傳代6代以上，提取球體細胞；

④將收集的球體細胞分成三份，通過球體細胞干性基因的檢測、裸鼠活體致瘤實驗和化療抵抗試驗測定其干細胞特性。

3.根據權利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，其特征在于：所述步驟（1）的①中選取的胃癌細胞株為MKN-45、BGC823、NCI-N87以及SGC7901。

4.根據權利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，其特征在于：步驟（2）中差異表達miRNA的驗證具體為：選擇10個有差異表達的miRNAs作進一步的qRT-PCR驗證。

5.根據權利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，其特征在于：所述步驟（2）中選擇的10個有差異表達的miRNAs分別為：miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-21-5p、?miR-27a-3p、miR-22-3p、miR-4270、miR-483-5p、miR-16-5p、let-7b-3p和miR-34a-5p。

6.根據權利要求1所述的一種miRNAs在胃癌干細胞中表達譜的分析方法，其特征在于：步驟（2）中差異表達miRNA的生物信息學分析具體為：

（a）分析目標

根據懸浮球細胞與親代貼壁細胞差異表達的microRNAs的結果及驗證分析結果，預測這些microRNAs對應的靶基因，并對這些靶基因的可能功能進行網絡分析，從系統生物學水平推測胃癌干細胞中microRNAs所調節的關鍵性分子和網絡；

（b）分析方法

對于10個有差異表達的miRNAs，采用MiRanda,?TargetScan以及Pictar三個在線數據庫的交集，對10個miRNAs的靶基因作預測，并進行生物信息學分析；三個在線數據庫的網址分別是：miRanda?：http://microrna.?sanger.ac.uk；TargetScan?：http://?www.targetscan.org；PicTar:http://www.ncrna.org/KnowledgeBase/link-?

Database/mirna_target_database。