[發明專利]一種利用SNP提高白樺細胞中總三萜和齊墩果酸含量的方法

有效

• 申請號: 201410260611.X
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104031970B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 詹亞光;曾凡鎖;辛穎;劉堃;齊鳳慧;范桂枝;尹靜;由香玲
• 申請（專利權）人: 東北林業大學;詹亞光;曾凡鎖
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種利用SNP提高白樺細胞中總三萜和齊墩果酸含量的方法。

背景技術

白樺樹皮中具有重要的三萜類物質，三萜類物質可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡或者抑制血管生成等方式發揮抗腫瘤作用，此外三萜類物質還有抗炎、抗病毒的作用。隨著三萜化合物生物活性的發現其在醫藥衛生方面的價值逐步顯現，目前已有以齊墩果酸等為主要成分的藥物投入臨床使用。然而，樹木生長周期長，若獲得白樺三萜需對樹木進行砍伐或扒皮，破壞資源，加之其結構復雜，人工方法合成效率低，成本高等因素而成為制約其不能進行臨床大規模應用的主要原因。以細胞全能性為基礎建立起來的植物細胞培養技術為植物藥生產提供了一條新途徑。由于利用植物細胞培養法生產植物天然活性物質具有不受氣候、病蟲害等自然條件的影響,而且不占用土地,不消耗自然資源,生產周期短和人為可控等優點，因而被認為是解決植物藥生產與天然植物資源可持續發展之間矛盾的一種新型生物技術。大量研究表明NO是植物次生代謝產物合成信號轉導網絡中的關鍵分子，具有重要作用。但目前尚未見使用NO的供體物質SNP促進白樺花藥的愈傷組織和懸浮培養細胞進行合成白樺三萜和齊墩果酸的報道。

發明內容：

為保護白樺自然資源，建立可持續開發利用的資源生產程序，利用來自白樺花藥誘導的愈傷組織和懸浮培養細胞，進行總三萜和齊墩果酸的合成與生產，同時利用高效液相色譜法進行定量檢測。為進行工業化法大規模生產總三萜和齊墩果酸類藥物的提供了新方法。

技術方案是：在超凈工作臺上，切下雄穗，用70％酒精浸泡5min，再用5％的次氯酸鈉溶液消毒20min，然后放于已滅菌的培養皿中，選擇適宜大小的雄穗，在解剖鏡下用解剖針剝開雄穗，取出花藥，接種到預先經過高溫高壓滅菌的各種組合的培養基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3％蔗糖+0.5～4.0mg/L2，4-D,0.2～4.0mg/L?KT)進行愈傷組織的誘導。每瓶接種大約30-35個花藥。先用暗培養一周后進行光培養。培養約7周后，獲得花藥培養愈傷組織。愈傷組織經過繼代培養后，迅速增殖。

選擇細胞生長速度快，松散且總三萜物質含量高的愈傷組織，進行繼代和懸浮培養。并在有利于白樺懸浮細胞生長和次生代謝產物積累的B5+0.1～0.3mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L?TDZ懸浮培養基中培養細胞系。獲得高產白樺三萜和齊墩果酸懸浮細胞系，經過濾，烘干，粉碎，有機溶劑(95％乙醇)提取步驟，利用液相色譜方法對白樺酯醇和齊墩果酸檢測和定量分析。

本專利具有以下特點：

1)生產環境不受地域、季節、水質、病蟲害、氣候等自然環境的影響。

2)生產周期短，生產過程不產生大量廢渣廢水，安全無污染，具有生態效益。

3)培養的白樺懸浮細胞具有生產白樺三萜和齊墩果酸等多種物質的能力，實現了白樺天然植物資源及其藥用成分的開發利用。

4)利用高效液相色譜方法進行齊墩果酸進行檢測，方法簡單，提取溶劑清潔無毒，操作方便。

5)為解決抗艾滋病和抗腫瘤天然藥物來源緊缺，加速臨床大規模應用，提供一種新途徑，具有很高的經濟效益和社會效益。

具體實施方式

1)植物材料來源

白樺取自東北林業大學白樺強化種子園內的開花優樹。選擇雄穗，取出花藥，消毒后接種到預先經過高溫高壓滅菌的各種組合的培養基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3％蔗糖+0.5～4.0mg/L2，4-D,0.2～4.0mg/L?KT)進行愈傷組織的誘導。愈傷組織經過繼代培養后，迅速增殖。挑選生長狀態良好的愈傷組織將其多次繼代后轉移至液體培養基懸浮培養。經過6代以上的轉接，建立穩定的懸浮培養細胞體系，懸浮培養繼代周期為15d，接種量為5g細胞于100mL液體培養基中。

2)培養條件

以白樺花藥懸浮細胞為實驗材料，按50g/L接種量接種于100mL?B5液體培養基中，培養條件為：120rpm，25℃，光照強度2000lx，光周期16h，濕度40％～50％，培養周期為10d。培養基成分為B5基本培養基，附加激素及濃度為0.2mg/L6-BA和0.6mg/L?TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白1g/L，pH5.5～6.0，121℃高溫高壓滅菌20min。

3)誘導子添加