[發(fā)明專利]一種解脂耶氏酵母W29脂肪酶的分離純化方法

無效

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• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104059895A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發(fā)明（設計）人: 吳蘭;葛剛;張小琴;周興濤;余祥單;劉以珍
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12R1/645
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發(fā)明涉及分離純化技術領域，尤其涉及一種解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的分離純化方法。

背景技術

解脂耶氏酵母菌(Y.lipolitica)首次發(fā)現(xiàn)于1942年，是一種非常規(guī)性的、不致病的、嚴格好養(yǎng)的酵母，屬于子囊酵母。常生活在含肉質(zhì)沙拉、醬油等富含脂類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的地方，其生長溫度為25～30℃，生存pH3.0～8.0，可以利用疏水物質(zhì)如乙醇、油類、脂肪酸，烷烴類如氯化烷烴、聚甲基化，糖類如葡糖糖、蔗糖、麥芽糖等作碳源進行生長。Y.lipolitica能產(chǎn)生大量的有機酸(如a-酮戊二酸、檸檬酸、異檸檬酸等)、胞外酶(胞外酸性蛋白酶、胞外堿性蛋白酶、胞外脂肪酶和酯酶酯、胞外磷酸酶、胞外RNase、a-甘露糖苷酶等)等產(chǎn)品，它的蛋白分泌模式具有典型性，常被用于研究蛋白質(zhì)分泌的模式生物，基于以上特性使得其在科學研究、工業(yè)領域都得到了廣泛的應用。特別是其對油脂廢水處理方面的運用，如吳蘭等發(fā)現(xiàn)Y.lipolitica W₂₉對色拉油和餐飲油廢水有較高的降解能力，即在溫度為25～30℃、pH6.0～7.0、培養(yǎng)時間為50h、搖床轉(zhuǎn)速200r/min的條件下，對油含量≤2000mg/L的色拉油和餐飲廢水的降解率達到了93.3％和85.08％，且發(fā)現(xiàn)Y.lipolitica W₂₉通過產(chǎn)生脂肪酶來對油脂進行降解。

1948年，Nelson和Peters首次報道了解脂耶氏酵母能產(chǎn)大量脂肪酶，其可以在異相或有機相中催化水解、酯化、轉(zhuǎn)酯、氨解等反應，且底物廣泛，具有很高的底物特異性、區(qū)域選擇性和對映選擇性。這些優(yōu)點使其擁有廣泛的工業(yè)用途，如環(huán)保、洗滌、有機物合成、油脂加工、食品加工、藥物合成、生物能源等。Gerardo等發(fā)現(xiàn)用橄欖油或玉米油做碳源以及誘導劑、在培養(yǎng)基中添加吐溫-80、降低通氣量都可以使Y.lipolitica提高脂肪酶的產(chǎn)量；Destain等利用突變的方法提高Y.lipolitica的產(chǎn)酶能力，使其產(chǎn)酶能力提高了近30倍；Ficker等運用誘變的方法篩選出解除葡萄糖抑制的Y.lipolitica菌種，其產(chǎn)酶酶活提高了10倍；Pignede等運用分子生物學手段從Y.lipolitica中獲得了Lip2基因，發(fā)現(xiàn)表達Lip2有脂肪酶特性，但當敲除Lip2基因后，Y.lipolitica在僅以三丁酸甘油酯為碳源的平板上還能正常生長，說明Y.lipolitica中還存在其他的降解三丁酸甘油酯的途徑。

不同微生物來源的脂肪酶有著不同的催化特性和催化活力，其組成成分也各有不同，因此分離純化脂肪酶的方法和步驟也有所不同。微生物脂肪酶分離純化主要通過兩大技術：1)沉淀技術，主要包括硫酸銨、乙醇和丙酮沉淀；2)層析技術，主要包括離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾等來完成。為了獲得最大的酶回收率和純化倍數(shù)，通常在脂肪酶提取純化過程中采用多步純化法。一般先用非特異、低分辨率的操作單元濃縮樣品，以此濃縮蛋白樣品并提高目的蛋白濃度，去除最主要的雜質(zhì)；然后采用高分辨率的操作單元如離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析等。后者一般具有高選擇性分離規(guī)模大的離子交換層析和親和層析放在前面，而將凝膠過濾層析這類分離規(guī)模小、分離速率慢的操作單元放在最后，這樣可以有效提高分離效率，減少蛋白損失。

因此，尋找簡單易行的脂肪酶分離純化方法對于解脂耶氏酵母W₂₉的利用有著重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的分離純化方法。

本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明的解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的分離純化方法的具體步驟如下：

(1)往含有解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的發(fā)酵上清液中加入含有EDTA的飽和硫酸銨溶液，使其終飽和度為30-55％，然后調(diào)節(jié)pH至4.5-6.5，在冰上放置10h后，進行離心得到沉淀；

(2)將步驟(1)得到的沉淀，進行透析除鹽，得到粗酶液；

(3)將步驟(2)得到的粗酶液進行低速離心，然后通過DEAE-SepharoseFF凝膠過濾層析，然后收集洗脫液，將洗脫液經(jīng)PEG20000濃縮后，與甘油混合，放入-20℃下保存。

步驟(1)中，EDTA在溶液中的最終濃度為1mM。

步驟(1)中，硫酸銨溶液的終飽和度優(yōu)選為45％。

步驟(1)中，使用硫酸或氨水調(diào)節(jié)pH值。

步驟(1)中，優(yōu)選調(diào)節(jié)pH至6.0。