[發明專利]單個金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法

有效

• 申請號: 201410259872.X
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104032006A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 張磊;汪聯輝;胡艷玲;黃維;李亞欣
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 王月霞;唐循文

技術領域

本發明涉及表面等離子體共振探針，具體涉及一種單個金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法。

背景技術

肺癌是世界范圍內最常見、致死人數最多的肺原發性惡性腫瘤，并且近三十年來許多國家報道其發病率明顯增高。因此早期診斷肺癌具有非常重要的意義。常用的腫瘤診斷手段包括痰細胞和胸部X線造影檢查、CT、核磁共振、PCR、B超、紅外掃描等。然而早期患者癥狀不典型或者沒有自覺癥狀導致診斷率低，同時傳統的肺癌篩查方法過程痛苦、耗資大，使得高危人群的依從性較差。因此眾多學者致力于肺癌標志物進行早期診斷。

在肺癌發生的早期，很多肺癌標志物可以反映腫瘤的存在，包括胚胎抗原（CEA）、細胞角蛋白19降解片段(cyfra21-1)、神經元特異性烯醇化酶（NSE）、糖類抗原（CA125等）、組織多肽特異性抗原（TPS）、乳酸脫氫酶（LDH）、基質金屬蛋白酶（MMPs）、以及核酸標志物MicroRNA（如miR-29，miR-202，miR-203，miR-205等）。

近年來，基于納米材料的生物檢測技術日益成熟，基于金納米粒子的表面等離子共振生物傳感器具有化學穩定性好、免標記、能夠實現實時快速檢測等優點，可以用于檢測腫瘤早期血液樣本中的低豐度核酸標志物，為實現肺癌早期檢測帶來了新希望。

發明內容

技術問題：本發明提供了一種基于單個金納米顆粒表面等離子共振探針及其制備方法，以及用該探針動態檢測肺癌核酸標志物的方法，并驗證了該探針的普適性。

本發明技術方案如下：

單個金納米顆粒表面等離子共振探針，為發夾形單鏈DNA修飾的納米金表面等離子探針，其結構是將球形金納米顆粒固定在預處理過的玻璃表面，發夾形的識別單鏈DNA通過功能基團連接到金納米顆粒表面。

所述識別單鏈DNA的序列為：5’-TGA?CT?-X-?AGT?CAT?TTT?TTT?TTT-(CH₂)₆-SH-3’，其中X部分序列為T?CAA?CAT?CAG?TCT?GAT?AAG?CTA，C?AGA?CTC?CGG?TGG?AAT?GAA?GGA或者C?TAG?TGG?TCC?TAA?ACA?TTT?CAC。

所述單個金納米顆粒表面等離子共振探針以金納米球為基礎，球形金納米顆粒的粒徑直徑在40~90?nm之間，散射光譜峰位于540~600?nm。

本發明的單個金納米顆粒表面等離子共振探針的制備方法包括以下步驟：

1）金種子溶液的制備：將2~8?mL40?mM檸檬酸鈉溶液一次性加入到沸騰的40~60?mL0.01%HAuCl₄溶液中，加熱煮沸5~30?min；

2）球形金納米顆粒的生長：在燒杯中加入10~30?mL水、0.5~5?mL步驟1）制備的金種子溶液和0.1~5?mL0.2?M鹽酸羥胺溶液，以0.06?mL/min的速度加入1~10?mL0.1%HAuCl₄溶液，得到金納米溶液；

3）金納米顆粒玻璃基底的制備：將ITO玻璃依次浸入洗潔精溶液、丙酮、無水乙醇、超純水中超聲清洗0.5~5?h，取出后用N₂吹干備用；取步驟2）中的金納米溶液0.5?mL，按比例1:1~1:50稀釋后，放入ITO玻璃片，浸泡0.5~20?min后用超純水沖洗并用N₂吹干；

4）發夾形DNA分子的修飾：將步驟3）中制備的金納米顆粒玻璃基底浸泡在1?μM的發夾形單鏈DNA溶液中，經搖床20~30℃搖勻5~20?h，取出玻璃基底用超純水沖洗并用N₂吹干，得到單個金納米顆粒表面等離子共振探針。

所述的單個金納米顆粒表面等離子共振探針在動態檢測肺癌標志物中的應用。

本發明所述識別單鏈DNA的序列為：5’-TGA?CT?-X-?AGT?CAT?TTT?TTT?TTT-(CH₂)₆-SH-3’，其中X部分序列可以根據檢測對象miRNA來設計，設計為任意想檢測對象miRNA的互補鏈，即可實現目標對象的檢測。