[發明專利]一種從種傳和土傳媒介中定量檢測稻曲病菌的方法

有效

• 申請號: 201410259131.1
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN104032003A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 孫文獻;韓彥卿;彭軍;張楠;方安菲;張亢
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及微生物領域，尤其涉及的是一種從種傳和土傳媒介中定量檢測稻曲病菌的方法。

背景技術

稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea?virens，有性態為Villosiclava?virens)侵染造成的一種水稻穗部真菌病害；病原菌侵染導致水稻小花上形成體積數倍于稻粒的病原菌菌落，即稻曲球。近年來，隨著優質雜交稻的推廣和大面積種植，大量氮肥的應用，為稻曲病的發生流行創造了有利條件，由一個歷史上零星、偶發性病害演變成為中國各水稻產區的主要病害之一。稻曲病的發生不但對水稻的產量造成很大影響，而且稻曲病菌能夠產生大量毒素，對人、動物和植物的細胞分裂具有強烈的抑制作用。因此，稻曲病的發生不僅使水稻減產，而且還會污染糧食，影響到糧食安全，控制稻曲病任重道遠。

稻曲病的癥狀只在水稻的生育后期顯現，出現在水稻的穗部，在此之前水稻植株的葉片、莖稈等部位沒有任何發病癥狀。在田間的自然條件下，一般在水稻開花后1周左右開始有幼嫩的稻曲球出現，開花3周后稻曲球體積達到最大并在其外圍產生大量的厚垣孢子。在晝夜溫差較大的天氣條件下，水稻成熟晚期稻曲球的表面可形成一至數個形狀不規則的菌核，菌核可在一定條件下萌發產生子囊孢子，可能成為下一次侵染的菌源。

目前對稻曲病的研究比較有限，很多基礎理論問題研究很少，對于病原菌的侵染機制，病害循環等存在很多爭議，而這些問題的解決對于如何開展快速分子檢測以及有效病害綜合防控十分重要。最近，對稻曲病的侵染位點以及侵染的機制有了重大突破。通過對稻曲球的連續切片表明，稻曲病的初侵染位點是水稻的花絲組織，并最易侵染位于子房和漿片之間的3個花絲。稻曲病菌從不侵染水稻子房和花藥，但偶爾會有次生菌絲侵染柱頭和漿片的外圍組織。病原菌侵染模式屬于細胞外侵染和擴展，病原菌菌絲不直接穿透和進入寄主細胞，只在細胞間穿行，并最終將花絲組織的細胞壁完全降解。在稻曲球發育過程中，稻曲病菌雖然產生毒素但并不直接殺死寄主細胞，因此稻曲病菌屬活體營養型病原菌。此外，通過GFP標記的菌株，Hu?et?al.對稻曲病的初浸染位點的研究結果則進一步證實稻曲病是通過小穗內部的花絲進行初侵染的。菌絲在人工接種后24h開始浸染，在接種后168h后菌絲累計達到最高水平，在水稻抽穗前，菌絲沿著感染的花絲向上延伸到達花藥的頂端后包裹所有的花器官并產生稻曲球。

雖然取得上述重大突破，但是對于稻曲病的病害循環，一直未取到一致性的研究結果。早在20世紀60年代，Ikegami等就對稻曲病菌的苗期侵染進行了組織學研究。結果發現，稻曲病菌可以成功侵染水稻萌發初期的幼嫩胚芽鞘，但并沒有發現稻曲病菌能夠像黑粉菌那樣抵達植株莖尖部的穗原基。此外，后續稻曲病菌的苗期侵染進行細胞學觀察發現稻曲病菌可侵染水稻幼嫩的胚根，而PCR檢測結果表明整個植株包括穗和籽粒都可攜帶病原菌。

通過對稻曲球進行形態學觀察以及采用GFP標記菌株研究稻曲病的侵染位點和侵染機制都已經證實稻曲病是特定時期(水稻抽穗期)、特定位點(小穗內部的花絲)侵染的。此外，研究表明厚垣孢子雖然可以存活在種子以及土壤中，但是厚垣孢子萌發后只能存活非常短的時間，可能沒有足夠的時間在水稻孕穗期充當初侵染源完成侵染，也說明稻曲病菌在苗期侵染后，在自然條件下很難或不能有效擴展到穗部并引發病害。目前對水稻種子帶菌是否可導致水稻發病存在大量爭議，發病穗率比較低，遠遠低于高發病年份高感品種田間自然發病率。

最近研究顯示稻曲病孢子可以附生定植在生物和非生物表面。高濕無水的狀態下，稻曲病孢子可以無癥狀的侵染并定植在禾本科，十字花科以及茄科的植物葉片。而在有水條件下，在植物葉片、保鮮膜或玻璃紙上，這些孢子幾天后就可以萌發并且形成菌絲，部分孢子還可以直接產生次生孢子。此外，如果逆向缺水處理，這些孢子要么出芽形成新孢子，要么反向形成厚垣孢子。這些結果顯示稻曲病菌具有附生特性，越冬后的菌核或厚垣孢子附生在水稻或者中間寄主上，比如稗草，白茅以及浮萍。在高濕或者雨天萌發成為孢子并且附生在不同植物或者非生物材料的表面，水稻孕穗期隨著雨水和風等媒介侵染水稻小穗從而導致發病。這些發現說明種子帶菌是也可能成為稻曲病的初侵染源。綜上所述，土壤中散布的菌核以及種子攜帶的厚垣孢子都可能是稻曲病的初侵染原。因此，必須有一種快速穩定、靈敏的定量檢測方法對土壤和種子攜帶的稻曲病菌進行檢測，對稻曲病的發病進行預警，是水稻安全生產的重要保證之一。