[發(fā)明專利]一種從種傳和土傳媒介中定量檢測(cè)稻曲病菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410259131.1
• 申請(qǐng)日: 2014-06-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104032003A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫文獻(xiàn);韓彥卿;彭軍;張楠;方安菲;張亢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種從種傳和土傳媒介中定量檢測(cè)稻曲病菌的方法，其特征是，其步驟如下：

(1)對(duì)被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，快速提取被檢樣品的DNA；

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系為：2.5μL10×PCR?buffer，2μL2.5mM?dNTPs，0.25μL5U/μL?Taq聚合酶，10pM引物uvr1497F/UV-B3各1μL，1μL提取的水稻稻曲病基因組DNA，補(bǔ)滅菌蒸餾水至25μL；其中，uvr1497F的序列為5′-CCGCTGCCTAAGATAAAGTCC-3′，UV-B3的序列為5′-CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3′；

PCR反應(yīng)的條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延長(zhǎng)90s、進(jìn)行35次循環(huán)；72℃延長(zhǎng)7min；反應(yīng)結(jié)束后，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，在1％瓊脂糖凝膠電泳上分離擴(kuò)增產(chǎn)物，EB染色觀察結(jié)果；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物從凝膠上切取并用試劑盒回收，回收后產(chǎn)物連接到pMD-18-T載體，測(cè)序驗(yàn)證序列后，將該質(zhì)粒命名為pMD18-T-UV，其濃度為10ng/μL；用該質(zhì)粒DNA作為模板，10倍梯度系列稀釋后用于構(gòu)建檢測(cè)稻曲菌的RealAmp標(biāo)準(zhǔn)曲線；RealAmp標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)種子中pMD18-T-UV的質(zhì)粒濃度與相應(yīng)的Tt值之間的關(guān)系而構(gòu)建的，X軸表示起始模板濃度的對(duì)數(shù)值，Y軸表示不同濃度模板擴(kuò)增達(dá)到閾值所用的時(shí)間Tt；

(3)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)反應(yīng)

RealAmp反應(yīng)體系：總體積為25μL，1μL提取并純化后的樣品DNA作為模板，2.5μL10×Bst?DNA?polymerase?buffer、1.0μL濃度為0.2μM的外側(cè)引物UV-B3和UV-F3、0.5μL濃度為1.6μM的內(nèi)側(cè)引物UV-FIP和UV-BIP、1μL濃度為8U/μL的Bst?DNA?polymerase、1.0μL濃度為0.2μMSYTO-9熒光染料，補(bǔ)滅菌蒸餾水至25μL，然后再加入等體系的石蠟油覆蓋整個(gè)反應(yīng)液防止揮發(fā)；其中UV-F3的序列為5′-CTTGTGTTTTCCAATGCATGT-3′，UV-B3的序列為5′-CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3′，UV-FIP的序列為5′-ATGCCCGCCAGAATACTGGCGCAGAATTCAGTGAATCATCG-3′，UV-BIP的序列為5′-CCTCAAGCTCTGTCTTGCGACGAGACCGCCGATTCATTT-3′；RealAmp反應(yīng)在ESE-QuantTubeScanner上進(jìn)行，63℃反應(yīng)90min，隨后在80℃孵育10min以終止反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后儀器自動(dòng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示定量結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(3)中，10×BstDNA?polymerasebuffer含有1.4mMdNTPs、0.8mM甜菜堿和8mM?MgSO₄。