[發明專利]檢測5-HTTLPR片段多態性的方法和引物

無效

• 申請號: 201410258375.8
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN104120177A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 王淑一;周曉犢
• 申請（專利權）人: 杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐關壽

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及檢測5-HTTLPR片段多態性的方法和引物。

背景技術

強迫癥是一種異質性高、病因復雜的精神障礙，國內外對其病因學的研究至今仍無定論，不少學者致力于遺傳學、精神應激與環境、神經內分泌以及突觸可塑性方面的研究，其中遺傳因素起到了重要作用。

關于強迫癥遺傳學方面的研究結果也不盡相同，其中研究最多的就是5-HTTLPR片段多態性與強迫癥的相關性。5-HTTLPR是5-羥色胺轉運體基因連鎖多態性區域(serotonin?transporter?gene-linked?polymorphic?region)的簡稱。5-HTTLPR片段的多態性是5-羥色胺轉運體(serotonin?transporter,5-HTT)基因的常見多態性之一。5-HTTLPR位于5-HTT基因轉錄起始點上游大約1kb處的啟動子區，為富含GC的20～30bp重復元件的重復序列。5-HTTLPR片段存在44bp片段插入缺失多態性，影響著5-HTT基因的轉錄活性。5-HTTLPR片段的多態性產生長片段(L)等位基因和短片段(S)等位基因。L等位基因的轉錄活性比S等位基因高2.5倍。5-HTTLPR可能通過影響5-HTT基因的轉錄活性和5-HTT蛋白的功能而影響5-羥色胺(serotonin,5-HT)的再攝取速率，使5-HT的功能有所改變。

迄今為止，探討5-HTTLPR片段多態性和強迫癥之間關聯性的研究，存在許多矛盾之處，周云飛等在漢族人群中對61例強迫癥患者與68名相匹配的正常人進行研究，結果顯示5-HTTLPR片段多態性的基因型與對照組差異無顯著性，而L等位基因與強迫癥呈正相關，使其患強迫癥的危險性提高了1.929倍，是強迫癥的危險因子。王振等研究認為5-HTILPR與強迫癥無相關性。Ramoz等通過對352個家庭的大型隊列研究，認為5-HTTLPR變異體沒有參與強迫癥。而Baca-Garcia等所做的研究認為5-HTTLPR的多態性中L等位基因與強迫癥的發生有關，McDougle等研究也顯示5-HTTLPR多態性的L等位基因與強迫癥呈正相關，而與選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective?serotonin?reuptake?inhibitors,SSRIs)的療效呈負相關。Bengel等則認為，強迫癥與5-HTTLPR基因型LL呈顯著性相關。另有研究結果顯示強迫癥患者基因型與等位基因頻率與對照組均有差異，強迫癥患者LL基因型與非LL基因型的比值比為1.086，說明LL基因型使強迫癥的患病風險增加了1.086倍，這與Bengel等的研究一致。在強迫癥患者中，LL基因型的耶魯布朗強迫量表(Yale-Brown?Obsessive?Compulsive?Scale,YBOCS)分值明顯高于LS型與SS型，說明LL基因型與強迫癥的嚴重程度呈正相關。

許多強迫癥患者常有家族史，甚至他們的父親和/或母親同樣是強迫癥患者，眾所周知，家庭是社會支持系統的重要組成部分，這與許多研究結果一致。已有研究發現，父母離異是強迫癥患者的危險因素，與強迫癥發病呈負相關，然而寇長貴認為是否是單親家庭與強迫癥等神經癥的發病無統計學關聯，可能與所選對象不同有關。

由于強迫癥的發病機制較復雜，遺傳因素在強迫癥的發病機制中占有多大比例，是否與社會環境因素相互作用等一系列問題，都需進一步研究。

目前針對5-HTTLPR多態性的檢測普遍采用的是聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法和測序法。RFLP法用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶。該方法簡便，結果容易判定，但是也同時存在諸多弊端，①靶片段的擴增產物要純，如在非特異性的擴增產物(特別是大片段可能含有限制性酶切位點)存在下，靶片段的擴增產物可能會發生不完全酶切或酶切后出現雜帶；②酶切過程要充分(即底物與酶的比例要合適，消化時間要保證)，才能避免假陰性結果產生；③酶切陽性結果可以確定所檢測的具體序列，陰性結果僅可說明靶片段的擴增產物是非內切酶識別序列，但不能準確判定具體序列；④酶識別序列如有甲基化的堿基，那么將不會被內切酶切割。測序法可以比較直觀的判斷5-HTTLPR的多態性，但是5-HTTLPR的多態性涉及大片段堿基的缺失或插入，因而測序可能出現檢測失誤的可能。而本發明采用PCR擴增反應后電泳直接顯帶的方法，可以有效地克服PCR-RFLP法和測序法引起的缺陷，從而快速、準確、簡單和低成本地檢測樣品。

發明內容