[發明專利]渦蟲染色體標本的制備方法

有效

• 申請號: 201410257817.7
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN103983497A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 馬克世;盛東峰;武安泉;王永立;楊同文;陳龍
• 申請（專利權）人: 周口師范學院
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 河南科技通律師事務所 41123
• 代理人: 樊羿

技術領域

本發明屬于細胞遺傳學領域，具體涉及一種渦蟲染色體標本的制備方法。

背景技術

渦蟲在我國分布廣泛，在動物演化史上，渦蟲是首次出現兩側對稱、三胚層的類群，進化地位十分重要，是發育生物學、細胞遺傳學和再生生物學研究的好材料。渦蟲的染色體制備是對其進行遺傳學研究的基礎，也是細胞及分子生物學研究的基礎。

現有成熟的動物染色體標本制備方法多適用于高等脊椎動物以及人類，可以采骨髓或血液處理后制備；而渦蟲只有組織液，無脊髓和血液，取樣處理困難。現有技術多采用李光鵬（《動物學雜志》1992，27（5），30~31）的方法，但其結果不穩定，制片不清晰，不利于研究分析，存在較大改進空間。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提出一種渦蟲染色體標本的制備方法，采用本發明方法能夠得到穩定而清晰的渦蟲染色體標本，方便對渦蟲染色體進行研究。

本發明使用的技術方案是：

一種渦蟲染色體標本的制備方法，包括以下步驟：?

（1）取材及預處理：選取體長3~5cm活潑健康渦蟲，置于去氯自來水中，饑餓1~2周至無代謝廢物排出；

（2）再生組織培養：將步驟(1)處理過的渦蟲置于載玻片上，待其完全伸展時，用消毒過的刀片將渦蟲切成3~5段，再置于10~15℃恒溫培養箱中無菌水培養3~5天，至斷面有白色再生組織長出；

（3）組織破碎及秋水仙素處理：將步驟（2）得到的渦蟲再生組織分離取下，置于離心管中破碎，然后加入0.2~0.25g/L的秋水仙素水溶液0.5~1.0mL，10~15℃靜置2.5~3.5小時，然后800~1000rpm離心5~6分鐘，棄去上清液；

（4）KC1低滲處理：步驟（3）處理后，加入0.1?~0.2g/L?KCl低滲液0.5~0.8mL（即KCl水溶液），進行低滲處理1.5~2.5小時，然后800~1000rpm離心5~6分鐘，棄上清液；

（5）組織固定及滴片：加入固定液I?1~1.5mL，使再生組織與固定液充分接觸后，靜置18~25分鐘，700~800rpm離心5~6分鐘，棄去上清；加入固定液II?1~1.5mL，使再生組織與固定液充分接觸后，靜置18~25分鐘，700~800rpm離心5~6分鐘，棄去上清；加入固定液Ⅲ?1~1.5mL，使再生組織與固定液充分接觸后，靜置18~25分鐘，700~800rpm離心5~6分鐘，棄去大部分上清，留下0.1~0.2mL液體，輕微震蕩得到組織混懸液，吸取上述混懸液，從5~6cm高度懸滴于載玻片上，均勻涂滿載玻片后，烘干或自然晾干；

（6）染色：將步驟（5）所得制片滴加Giemsa染色液1~2mL，至其能布滿載玻片，平放于通風櫥中靜置8~12分鐘后，用蒸餾水輕柔洗去染液，再置于酒精燈火焰上方2~3cm高度處均勻烤干，即得到染色體片；

（7）封片：在顯微鏡下初步觀察所得染色體片后，標記后封片保存，即得；

所述固定液I由乙醇和冰乙酸以體積比4:1組成，固定液II由乙醇和冰乙酸以體積比2:1組成，固定液III由乙醇和冰乙酸以體積比1:4組成。

對于上述的制備方法，步驟（2）所述刀片經乙醇消毒。

對于上述的制備方法，步驟（3）所述離心管為1.5~2mL離心管。

對于上述的制備方法，步驟（5）所述再生組織與固定液充分接觸的方式為搖動或超聲波震蕩。

對于上述的制備方法，所述Giemsa染色液為甘油含量為10~20wt%的Giemsa染色液。

本發明積極有益效果：

（1）本發明再生組織破碎后加秋水仙素可更加均勻充分的接觸再生組織細胞，有利于增加中期細胞的比例；

（2）本發明相對現有技術，低滲處理的力度和時間都有加強；

（3）本發明使用三個不同梯度固定液結合離心技術進行固定，能使再生組織和中期細胞得到充分固定；使用5~6cm高度距離滴片，細胞分散及破碎效果良好。?

本發明再生組織和中期細胞得到充分固定處理，染色體制片背景清晰、細胞分散良好、中期分裂相多，利于核型分析。

附圖說明：

圖1為由本發明方法制得的渦蟲染色體標本在電子顯微鏡成像圖。

具體實施方式：

下面將結合實施例對本發明的實施方式做進一步說明。

實施例1：