[發明專利]一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝

有效

• 申請號: 201410257052.7
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN104059865A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 韓秀云;李松田
• 申請（專利權）人: 濱州安華生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/26;C12R1/46
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

技術領域

本發明涉及生物多糖提取技術領域，特別是涉及一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝。

背景技術

國內目前有十幾家透明質酸的生產廠家，且這些企業大多數是用動物組織提取法。從動物組織中提?。龋脸Ｓ玫脑嫌须u冠、臍帶和豬皮等，主要工藝過程包括脫水、磨碎、浸泡、提取、除雜、沉淀和分離。這種方法的特點是工藝流程簡單，適用于原料來源分散的小規模生產。但由于原料有限，且原料中ＨＡ的含量低，同時ＨＡ又還與硫酸軟骨素等粘多糖共存于生物組織中，致使其收率低、提純難、成本過高、產品質量差，且難以應用于大規模生產。隨著ＨＡ需求量的不斷增大，迫切要求生產大量的高質量ＨＡ，動物組織提取法己不能適應這種要求。 國外從上世紀70年代開始研究利用發酵法生產透明質酸，采用發酵法生產的透明質酸質量穩定、原料易得，成本低。

目前微生物發酵法生產透明質酸采用的工藝發酵周期長、產物相對分子量低、產品透光率差、蛋白質含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明質酸的形態為纖維狀，不易溶解。

發明內容

本發明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝。本發明采用復合誘變技術篩選出透明質酸產率高的菌種，結合發酵技術，透明質酸產品產出率高，可達7-9g/L。發酵得到的透明質酸易于分離純化，生產周期短。生產易于控制，適合工業化大規模生產，收率高，并且大大降低了生產成本。

本發明的一種獸疫鏈球菌及用其制備透明質酸的生產工藝技術方案為，一種獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）AWA008，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號是：CGMCCNo.9111，保藏日期是2014年04月29日。

目前該獸疫鏈球菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101，其保藏編號是：CGMCCNo.9111，菌種的拉丁文名稱是Streptococcus zooepidemicus，參據的微生物（株）：AWA008，保藏日期是2014年04月29日。

本發明所述的獸疫鏈球菌菌株特征：呈球形或卵圓形，呈鏈狀排列，有莢膜，無芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。

所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，包括以下步驟：

（1）搖瓶種子液培養：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養液的1L錐形瓶中，培養，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中；

（2）菌種擴配：將培養液加入到種子罐中，進行蒸汽滅菌后，按無菌要求在種子罐里加入菌種培養，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中；

（3）發酵；

（4）提純。

所述的獸疫鏈球菌制備透明質酸的生產工藝，具體為：

（1）搖瓶種子液培養：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養液的1L錐形瓶中，37℃培養12-16小時，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中；

（2）菌種擴配：將培養液加入到種子罐中，進行蒸汽滅菌后，設定溫度36.3℃、pH6.86，按無菌要求在種子罐里加入菌種，維持罐壓0.05MPa，培養12-16小時，鏡檢觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于發酵罐中；

（3）發酵：將一半發酵培養液加入到發酵罐中，進行蒸汽滅菌后，設定溫度36.3℃、pH6.86，維持罐壓0.05MP，將種子罐的培養基全部壓入到發酵罐中，記錄pH值，在pH下降時加入另一半發酵培養液，保持各項指標，發酵液pH每分鐘下降幅度小于0.01時結束發酵，檢測發酵液粘度，將發酵液壓入沉淀罐中；

（4）提純，包括以下工藝：

①前沉淀：向沉淀罐里在攪拌情況下緩緩地加入95%的酒精，至產生雪花狀沉淀，控制在 47-50度（折至20℃時的酒精度），收集沉淀物；

②溶解：用氯化鈉溶液將沉淀物溶解，調節pH至9.3-9.5，加入EDTA、活性炭、珍珠巖，攪拌均勻；

③過濾：將溶解后的料液壓入1#大板框過濾一遍后，過濾液調pH9.3-9.5。再加入白硅藻土和珍珠巖后，攪拌均勻后，壓入2#大板框過濾第二遍。二遍過濾液中加入硅藻土，攪拌均勻后，料液通過不銹鋼板打循環澄清后，過濾第三遍，澄清度在99.5%以上，然后過濾液通過聚丙烯濾芯過濾至潔凈間沉淀罐；