[發(fā)明專利]一種植物病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器的制備方法及檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410255539.1
• 申請(qǐng)日: 2014-06-10
• 公開（公告）號(hào): CN103995031A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬偉;胥傳來;孔德昭;匡華;徐麗廣;劉麗強(qiáng);宋珊珊;吳曉玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/26
• 分類號(hào): G01N27/26;G01N27/30
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通用型植物病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器的制備方法及檢測(cè)方法，屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

西瓜花葉病毒（Water?melon?mosaic?virus-2，WMV-2）為馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）重要成員，主要通過多種蚜蟲以非持久性方式進(jìn)行傳播。Webb和Scott?根據(jù)寄主范圍的差異血清學(xué)關(guān)系及交互保護(hù)作用的有無把WMV分為WMV-1?和WMV-2兩株系，后來Purcifull?根據(jù)病毒在寄主上的反應(yīng)及血清學(xué)關(guān)系認(rèn)為WMV-1是番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya?ringspot?virus，PRSV）的?西?瓜?株?系(?PRSV-W），WMV-2株系即是現(xiàn)在的WMV。

自然條件下，西瓜花葉病毒可侵染葫蘆科藜科豆科等27科170多種植物，主要引起花葉葉片畸形等癥狀，世界很多國(guó)家都已報(bào)道了西瓜花葉病毒對(duì)葫蘆科作物不同程度的危害，很多國(guó)家的葫蘆科作物都受到了WMV不同程度的危害。

目前，植物病毒的檢測(cè)方法主要采用分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，但存在RNA抽提繁瑣且易降解的問題。血清學(xué)檢測(cè)由于其操作簡(jiǎn)單且能同時(shí)處理大量樣品而被廣泛采用，但需要購(gòu)買價(jià)格昂貴的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒，并且檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于抗體的質(zhì)量。

在這種情況下，建立一種快速靈敏特異性好的WMV檢測(cè)方法尤為重要。電化學(xué)工作站是電化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)的簡(jiǎn)稱，是電化學(xué)研究和教學(xué)常用的測(cè)量設(shè)備，可直接用于超微電極上的穩(wěn)態(tài)電流測(cè)量。納米材料是一種新型的具有特定功能的材料，碳納米管自1991年被日本科學(xué)家Ijima發(fā)現(xiàn)以來，由于其特有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及導(dǎo)電性能，一直受到人們的高度重視，基于碳納米管的傳感器的研制也層出不窮。

本發(fā)明以碳納米管及實(shí)驗(yàn)濾紙為材料，利用碳納米管對(duì)濾紙進(jìn)行Dip-Dry包裹，在包裹液中加入植物病毒W(wǎng)MV-2的抗體，制備可以響應(yīng)植物病毒蛋白的高速靈敏傳感器。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是制備一種能夠快速、高靈敏地檢測(cè)植物病毒的經(jīng)濟(jì)推廣型傳感器。

本發(fā)明的目的之二是建立基于制備的植物病毒傳感器的快速、高靈敏檢測(cè)方法及技術(shù)指標(biāo)。

本發(fā)明的目的之三是在發(fā)明目的一、二的基礎(chǔ)上，建立的通用型植物病毒傳感器的制備及檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種植物病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器的制備方法，其制備步驟為：

（1）碳納米管-苯乙烯磺酸鈉PSS溶液的制備：將PSS分散于水溶液中得到質(zhì)量濃度為12.5%的PSS水溶液，再將水溶性的羧基修飾的短臂碳納米管分散于PSS水溶液中，使碳納米管終濃度為30mg/mL，超聲儀中100W、40KHz功率超聲處理6h使得碳納米管在PSS水溶液中充分分散；

（2）抗體-碳納米管PSS溶液的制備：步驟（1）制備的碳納米管-PSS水溶液分散均勻后冷卻至室溫，加入植物病毒抗體溶液，得到抗體終濃度為15μg/mL的抗體-碳納米管PSS溶液；

（3）傳感器的制備：將固定長(zhǎng)寬度的濾紙浸沒到步驟（2）制備的抗體-碳納米管PSS溶液中，浸泡10min后取出，冷凍干燥后再次浸沒到抗體-碳納米管PSS溶液中10min后取出，冷凍干燥；其反復(fù)循環(huán)操作13個(gè)循環(huán)，4℃密封保存，即制得植物病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器。

所述植物病毒抗體為西瓜花葉病毒二號(hào)WMV-2抗體、即制得西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器；更換西瓜花葉病毒二號(hào)WMV-2抗體為建蘭花葉病毒抗體或齒舌蘭環(huán)斑病毒抗體，即制得建蘭花葉病毒或齒舌蘭環(huán)斑病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器。

所述植物病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器的檢測(cè)方法，步驟為：以植物病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器為工作電極，以通用型植物病毒配置系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液，建立檢測(cè)通用性植物病毒的電流-植物病毒濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；檢測(cè)樣品上清提取液的穩(wěn)定電流值，與所建立的電流-植物病毒濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，確定檢測(cè)樣品液中的通用型毒素含量。

當(dāng)所述病毒為西瓜花葉病毒時(shí)，具體步驟如下：

（1）受西瓜花葉病毒侵染的植物葉片標(biāo)本，加入2倍體積0.2mol/L、pH7.4、含質(zhì)量濃度為1%巰基乙醇的磷酸鈉緩沖溶液，勻漿，過濾，濾液10000r/min離心5min，上清提取液備用；

（2）所制得的西瓜花葉病毒紙質(zhì)檢測(cè)傳感器為工作電極，Pt電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，在電化學(xué)工作站控制下，記錄隨著時(shí)間流經(jīng)工作電極的電流，即i-t曲線；體系為pH7.9?Tris-HCl緩沖溶液，30℃下進(jìn)行檢測(cè)；