[發(fā)明專利]一種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410255297.6
• 申請日: 2014-06-10
• 公開（公告）號: CN104020240A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林靜;劉利平;湛嘉
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 郭婧婧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

雖然近年來鰻鱺的人工繁殖初見成果，但對于在其性腺發(fā)育過程中性腺組織中的性腺激素含量會在不同階段，并且隨著不同激素的注射而有所改變，尤其是雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、17α-羥孕酮、17α，20β-二羥-4-孕烯-3-酮(DHP)、睪酮、表睪酮對鰻鱺的成熟和產(chǎn)卵有著重要的影響。

在過去30年中，有大量的研究證實(shí)，睪酮和DHP二者相互協(xié)調(diào)，共同激發(fā)著鰻鱺精子的形成；魚類中，腦垂體分泌GtH，GtH含兩種糖蛋白促性性腺激素(即LH和FSH)，進(jìn)而促進(jìn)雄魚血液中DHP和睪酮的分泌來調(diào)控性腺的發(fā)育與成熟；而在雌魚中，這兩種激素會促進(jìn)分泌形成雌二醇，雌二醇會進(jìn)而刺激肝臟合成與分泌卵黃蛋白原；另一方面同樣會刺激濾泡顆粒細(xì)胞分泌DHP，DHP是誘導(dǎo)卵巢最后成熟與排卵的重要激素。Katsumi?Tsukamoto等對捕獲的日本鰻鱺通過RIA和TLC法對它們進(jìn)行血清類固醇激素的檢測，發(fā)現(xiàn)在日本鰻魚排卵期間，DHP約1ng/ml，而在人工催熟的日本鰻魚的同一期間沒有檢測這種類固醇激素，同時在人工繁殖的日本鰻魚的卵黃發(fā)生的中后期檢測血清中雌二醇(雌甾體類激素)含量為2-3ng/ml，睪酮(精子發(fā)生誘導(dǎo)類固醇)在捕獲的雄性鰻魚體內(nèi)的含量是很高的(2-5ng/ml)，含量類似與人工繁殖的成熟雄鰻中。因此，準(zhǔn)確掌握鰻鱺性腺組織中性激素周期性的濃度變化是決定人工繁殖鰻鱺成功與否的關(guān)鍵。

由于類固醇類激素在離體魚類性腺中的濃度通常很低，而離體魚類性腺作為魚類組織中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的器官，不僅蛋白質(zhì)含量高，而且油脂含量高，干擾物質(zhì)多，類固醇類激素作為脂溶性的激素，在提取的過程中很容易損耗。因此，本發(fā)明的目的在于建立可靠、穩(wěn)定的定性定量分析方法，并通過有效的富集、分離和純化過程實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高專屬性分析，為進(jìn)一步研究類固醇類激素在魚類性腺內(nèi)的代謝及消耗過程奠定基礎(chǔ)，為人工繁殖魚類提供科學(xué)方法。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種UPLC-MS/MS檢測離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的方法。所述方法能夠?qū)﹄x體魚類性腺內(nèi)八種類固醇類性激素：雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮、17α-羥孕酮、雌酮、17α，20β-二羥基-4-孕烯-3-酮(DHP)進(jìn)行同時分析檢測。本發(fā)明的方法通過對多成分類固醇類性激素含量的測定可以比較全面地反映性激素在性腺中累積、傳遞和代謝過程，為準(zhǔn)確評估魚類的發(fā)育時期提供依據(jù)。

為實(shí)現(xiàn)上述及其他目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法，為采用UPLC-MS/MS定性或定量檢測離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素，包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：稱取離體魚類性腺組織，經(jīng)前處理，得供試品溶液；

(2)對照品溶液的制備：稱取未成熟離體魚類性腺組織樣品，加入類固醇類性激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)和步驟(1)相同的前處理，得對照品溶液；

(3)測定：采用UPLC-MS/MS分別對供試品溶液和對照品溶液進(jìn)行定性或定量檢測。

較佳的，所述魚類為花鰻鱺魚或河鰻(日本鰻鱺)。

較佳的，所述類固醇類性激素選自雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮、17α-羥孕酮、雌酮或17α，20β-二羥基-4-孕烯-3-酮(DHP)中的一種或多種。

較佳的，步驟(1)中，所述前處理，包括如下步驟：

1)將離體魚類性腺組織樣品，加入勻漿介質(zhì)，勻漿，得勻漿液；

2)將所得勻漿液超聲，離心，冷凍；

3)將所得冷凍后的樣品，離心，取上清液進(jìn)行過濾，將所得過濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加步驟1)中所用勻漿介質(zhì)溶解，靜置；

4)離心，取上清液進(jìn)行過濾，得續(xù)濾液作為供試品溶液。

較佳的，步驟1)中，所述勻漿介質(zhì)為乙腈、甲醇中的任一種。

較佳的，步驟1)中，每1g的離體魚類性腺組織樣品中加入勻漿介質(zhì)8-15ml。更佳的，每1g的離體魚類性腺組織樣品中加入勻漿介質(zhì)10-15ml。

所述離體魚類性腺組織樣品稱取時，應(yīng)當(dāng)精密稱取。

所述甲醇為100％甲醇。