[發明專利]一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應用

有效

• 申請號: 201410254563.3
• 申請日: 2014-06-10
• 公開（公告）號: CN104031142A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 馬偉;胥傳來;孔德昭;匡華;徐麗廣;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K16/44;G01N33/53
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應用，屬于生物化工技術領域。

背景技術

葉酸（folic?acid或folate）又名碟酰谷氨酸，B族維生素之一，是氨基酸、嘧啶和嘌呤代謝中單碳轉移的載體，對核蛋白的合成起輔酶作用；同時，葉酸也是許多細胞內酶反應的輔酶；葉酸的缺乏，會導致dTMP的合成受到限制，使DNA合成受阻，而產生巨幼細胞貧血。目前的研究已經證實，婦女孕前或妊娠早期缺乏葉酸是神經管畸形發生的重要病因之一。葉酸與同型半胱氨酸代謝關系密切，對預防心腦血管疾病的發生具有重要的生物學意義。而且，也有研究表明，葉酸與許多癌癥的發生、預防以及治療相關。在我國，葉酸作為一種食品添加劑可以按照食品安全國家標準合法添加至食品中。

葉酸，化學名稱N-{4-[(2-氨基-1,4-二氫-4-氧代-6-喋啶）甲氨基]苯甲酰基}-L-谷氨酸，分子式C₁₉H₁₉N₇O₆，分子量441.40（按2007年國際相對原子質量），由蝶呤啶、對氨基苯甲酸和L-谷氨酸結合合成。

目前，根據檢測對象的不同，我國對葉酸的檢測方法主要有比色法薄層層析法、氣相色譜-質譜法（GC/MS）、高效液相色譜法（HPLC）、微生物法、同位素放射免疫法、酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)、膠體金試紙條法等。

儀器分析方法存在樣品須經多步稀釋、過濾、親和柱富集等前處理過程，存在制備復雜、繁瑣的缺點，其檢測成本高，周期長，無法滿足大批量樣本快速篩查，以及現場快速檢測的要求。ELISA和膠體金試紙條法屬于免疫分析技術，具有較高的靈敏度和特異性，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。而無論是儀器分析方法前處理過程中的親和柱富集還是免疫分析方法的檢測過程中，其至關重要的影響因素還是高特異性的抗原和抗體。

傳統的葉酸人工抗原一般采用混合酸酐法，小分子中的氨基可以在三級胺的作用下與氯甲酸異丁酯反應，生成活潑中間體混合酸酐，然后與載體蛋白上的伯氨基反應，形成酰胺交聯鍵。而葉酸小分子載體蛋白直接耦聯，由于載體蛋白與小分子之間的空間位阻關系，最終通過免疫動物得到的抗體往往是針對小分子的部分結構的，抗體的特異性和靈敏度會受到很大影響，尤其是對喋呤、蝶酸、四氫葉酸、二氫葉酸和對氨基苯甲酸等物質的交叉現象不可避免。

動物免疫抗體的產生是與載體分子的結構有關的。同樣，載體分子不僅影響產生抗體的數量，還影響著抗體的類型和親和力。有研究表明，半抗原與載體結構之間的多原子間隔空間的存在更容易產生具有高特異性和高親和力的抗體。

本發明是在載體蛋白上修飾具有一定空間長度的6-氨基己酸作為載體連接臂，將半抗原耦聯到載體蛋白的連接臂上，形成載體與半抗原間具有一定空間間隔的完全抗原。

發明內容

本發明的目的是針對現有葉酸抗原合成技術以及相應抗體的不足和缺陷，提供一種新型的葉酸完全抗原合成方法，使得制備高特異性的葉酸單克隆抗體成為可能，本發明的另一目的是提供葉酸完全抗原的應用。

本發明的技術方案，一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法，步驟為：在載體蛋白溶液中加入6-氨基己酸（ε-ACA）與水溶性碳二亞胺（EDC）后，室溫下反應，透析后得到修飾了連接臂的載體蛋白B（式1所示）；葉酸（N-{4-[(2-氨基-1,4-二氫-4-氧代-6-喋啶)甲氨基]苯甲?；鶀-L-谷氨酸）溶解于二甲亞砜（DMSO）中，加入二環己基碳二亞胺（DCC）與N-羥基丁二酰亞胺（NHS），反應生成葉酸衍生物，再加入載體蛋白B，調節反應pH值7.4，與載體蛋白B上的氨基進行偶聯，透析，得到高特異性的葉酸完全抗原（式2）。將完全抗原透析，然后進行紫外鑒定（圖1）。

載體蛋白修飾路線為：

式1?

葉酸人工抗原合成路線為：

式2

所述高特異性的葉酸完全抗原合成方法，具體步驟如下：

（1）修飾載體蛋白：取載體蛋白50mg溶解于5mL?pH9.6碳酸鹽緩沖溶液中，再加入100mg?6-氨基己酸，30mg水溶性碳二亞胺；調節體系pH值于6~8，室溫下反應4h；用PBS緩沖液透析2天，期間換水4次，即得到修飾了連接臂的載體蛋白B；

（2）葉酸完全抗原的制備：