[發明專利]具有高純度X－染色體和Y－染色體的精子群

有效

• 申請號: 201410254362.3
• 申請日: 2001-05-09
• 公開（公告）號: CN104004710B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 肯尼思·M·埃文斯;埃里克·B·范·芒斯特
• 申請（專利權）人: XY有限責任公司
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司11127
• 代理人: 丁香蘭

本申請是再次分案申請，其所針對的原分案申請的中國國家申請號為200810166001.8，申請日為2001年5月9日，發明名稱為“具有高純度X－染色體和Y－染色體的精子群”；該原分案申請的原申請的國際申請號為PCT/US01/15150，中國國家申請號為01810748.6，申請日為2001年5月9日，發明名稱為“具有高純度X－染色體和Y－染色體的精子群”。

技術領域

分離的具有高純度X－染色體或Y－染色體的精子群以及根據例如質量、體積、DNA含量等等區別特征分離精子、粒子、或事件的方法。

背景技術

分離的具有高純度X－染色體或Y－染色體的精子群可以被用于完成很多哺乳動物例如?？苿游铩ⅠR科動物、羊科動物、山羊、豬、狗、貓、駱駝、大象、公牛、水牛等等的卵細胞或卵母細胞的體內或體外的授精或人工授精。另見，美國專利5,135,759，在此引入作為參考。

但是，傳統的將帶有X－染色體和Y－染色體的精子群分離開的方法會產生低純度的精子群。不論何種方法，精子一直都沒有被分離成具有例如90％，95％，或大于95％的高純度的X－染色體或Y染色體的精子樣品。

有關直接或間接根據大小、質量、或強度差異將帶有Y－染色體的精子同帶有X－染色體的精子分開的一些方法已經被公開。如美國專利號4,474,875所公開的，對所有精子細胞同時應用一種浮力而使分離培養基中帶有X－染色體或Y－染色體的精子分離到不同的位置。美國專利號5,514,537公開了一種技術，其中精子穿過裝有兩種規格珠子的層析柱。帶有大的X－染色體的精子被分離到含有大珠子的層中，而帶有較小的Y－染色體的精子被分離到含有較小珠子的層中。美國專利No.4,605,558公開了可以使精子對密度梯度差分敏感的方法。而美國專利No.4,009,260利用了帶有X－染色體的精子和帶有Y－染色體的精子在通過柱中阻礙介質的遷移速率或游動速率的差異。

上面提到的每一項技術共同存在的問題是這些技術對精子以“大批量方式”起作用，意思是所有精子都在同一時間經受相同的處理，而帶有Y－染色體的精子細胞比帶有X－染色體的精子出來的更快更早，或處于不同的位置。這樣，單個的精子細胞不能被鑒定并且不存在實際的體積、質量、密度或其它精子細胞特征的“量度”。逐個鑒定精子細胞在實際分離過程中所能帶來的益處可以被檢測到，并且甚至在分離過程中能夠生成實物定量數據，和分離參數如所希望的發生變化。這些技術不能同流式細胞篩選裝置一塊使用。

用于分離精子的流式細胞儀技術也已經被公開。利用這些技術時應當用熒光染色劑對精子染色并使其在一束狹窄的流或譜帶－例如激光束一類的激發或照射源中流過。當被染色的顆粒或細胞經過激發或照射源時，熒光染色劑發出熒光?？梢酝ㄟ^光學裝置收集熒光，聚焦在象光電倍增管一類能夠產生并倍增電信號的檢測器上，然后用分析器進行分析。接著用多參數或單一參數的色譜圖或直方圖顯示這些數據?？梢杂眉毎臄的恳约懊總€細胞的熒光作為坐標。見美國專利No.5,135,759，在此引入作為參考。但是，針對這類技術仍然有大量沒有解決的問題并且分離高純度的帶有X－染色體或Y－染色體的精子細胞是困難的。

傳統的流式細胞儀技術的一個顯著問題是鞘液中的物質、顆粒、或者細胞的定向。當物質或者細胞相對于超過一個軸－例如精子－而使得形狀不規則時候，這尤其成為問題。這一問題的一個方面應當是在鞘液中建立物質的初始取向。這一問題的第二個方面是在被測物質發光期間保持物體相對于檢測器(光電倍增管或其它類似的儀器)的取向。

傳統的流式細胞儀技術的另一個顯著問題是不能將物質或細胞包裹在液滴中。尤其是，當在不規則形狀物體的周圍形成液滴時，液滴的大小不足以完全覆蓋物質或細胞的所有部分。例如，在流式細胞儀作用期間，如上所述的液滴能夠以很快的速度形成，甚至每秒10,000到90,000之多，在有些情況下每秒80,000個之多。當精子被包封在液滴中時，特別是以這樣快的速率，精子的尾部或頸部的一部分沒有被包封在液滴中。沒有被包封在液滴中的尾和頸的那部分會以某種干擾后面液滴形成或液滴正確偏轉的方式與噴嘴或液滴的周圍環境起反應。因此有些精子根本沒有被分析到從而降低了這一方法的效率，或者沒有被被消除到足以賦值給一個細胞群，或者偏離正常軌道，或者全部情況的組合發生。