[發明專利]一種制備高純度蘿卜硫素的方法

在審

• 申請號: 201410253792.3
• 申請日: 2014-06-03
• 公開（公告）號: CN104059947A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 劉慶海;萬玉萍;顏李秀;馮琳;周小華
• 申請（專利權）人: 重慶海巨農業發展有限公司;重慶大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種制備高純度蘿卜硫素的方法，其特征在于具體方法步驟如下：

(1).制備脫脂蘿卜籽粉

取水分含量低于4％的風干蘿卜籽，先用破碎機破碎，再用20～60目的不銹鋼篩網進行篩分，分別收集過篩者和未過篩者，對于未過篩的蘿卜籽粉，返回破碎機進行再次破碎，對于過篩的蘿卜籽粉，置于超臨界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在溫度為30～35℃、壓力25～30MPa的條件下進行萃取1h～2h，然后將荷載蘿卜籽油脂的超臨界二氧化碳泵至分離釜中，降低壓力至3～5MPa，使超臨界二氧化碳氣化，與蘿卜籽油脂分離，分別收集氣化的二氧化碳、脫二氧化碳蘿卜籽油脂粗品和脫脂蘿卜籽粉，對收集的氣化二氧化碳，再次冷凍至0～5℃并再次加壓至25～30Mpa；

(2).制備硫代葡萄糖苷提取液

第(1)步完成后，將第(1)步收集的部分脫脂蘿卜籽粉，分散于甲醇中，在70～75℃的溫度下進行第一次提取40～60min，脫脂蘿卜籽粉質量與甲醇體積之比為1g∶6～9mL，第一次提取完成后進行抽濾，分別收集第一次濾過液和濾渣，對于收集的第一次濾渣，投入到甲醇中進行第二次提取，提取條件與第一次相同，第二次提取完成后進行抽濾，分別收集第二次濾過液和濾渣，對于收集的第二次濾渣，送入脫溶劑釜中，進行脫甲醇處理，對于收集的第二次提取液，與收集的第一次提取液合并后進行真空濃縮，直至濃縮液成膏狀時止，所用濃縮真空度為0.06～0.09MPa、溫度為40～45℃，濃縮完成后，分別收集膏狀濃縮物和甲醇，對于收集的甲醇，返回甲醇貯罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷，對于收集的膏狀濃縮物，用蒸餾水溶解，膏狀濃縮物質量與蒸餾水體積之比為1g∶3～6mL，溶解完成后，將溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯進行萃取處理10～20min，溶解液與乙酸乙酯體積之比為1mL∶1～6mL，萃取完成后，分別收集萃取相和萃余相，對收集的萃取相，進行精餾回收乙酸乙酯；

(3).制備蘿卜硫素粗提液

第(2)步完成后，先將第(1)步收集的另一部分脫脂蘿卜籽粉分散于pH5.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液中，攪拌均勻，脫脂蘿卜籽粉質量與pH5.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液體積之比為1g∶6～12mL，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液體積與脫脂蘿卜籽粉質量之比為1mL∶10～20g，混合均勻后就獲得制備蘿卜硫素粗提液酶水解體系，然后在25～35℃、40～120r/min的攪拌速度下避光水解5～10h，水解完成后，進行過濾，分別收集濾過液和濾渣，對收集的濾渣，分散于溫度為25～35℃的蒸餾水中，蒸餾水體積與濾渣質量之比為10～20mL∶1g，在40～120r/min的攪拌速度下避光洗滌20～30min，接著進行過濾，分別收集洗滌濾過液和濾渣，對收集的洗滌液，與收集的水解濾過液合并，用稀鹽酸調節pH至2～4后離心，離心機轉速為10000～16000r/min，分別收集離心清液和離心沉淀，對收集的離心清液，泵入脫氣罐中，在真空度為0.06～0.09MPa、溫度為10～35℃的條件下，保持20～40min，脫去液體中的氧氣，然后充入0.1～0.3MPa的高純度氮氣，保持20～40min，即制備出蘿卜硫素粗提液；

(4).制備脫氧充氮甲醇-水洗脫液

分別配制甲醇體積濃度為5～15％、60～80％的甲醇-水溶液，再分別移入脫氣罐中，在真空度為0.06～0.09MPa、溫度為10～35℃的條件下，保持20～40min，脫去其中的氧氣，然后充入0.1～0.3MPa的高純度氮氣，保持20～40min，即制備出脫氧充氮甲醇-水洗脫液；

(5).制備蘿卜硫素初步純化濃縮液

第(3)步完成之后，將第(3)步制備出的蘿卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，吸附其中的蘿卜硫素，蘿卜硫素粗提液體積與SP850或聚酰胺吸附樹脂的體積比為1mL∶15～30mL，以流速為5～10BV/h通過SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，吸附完成后收集荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱和脫附蘿卜硫素的過柱溶液，對于收集的脫附蘿卜硫素的過柱溶液，進行生化處理，達標后排放，對于收集的荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，先用2BV、甲醇體積濃度為5～15％的脫氧充氮甲醇-水洗脫液、以3～6BV/h的流速洗滌夾雜于樹脂間的雜質，分別收集甲醇洗滌液和洗去樹脂間雜質的荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，對收集的甲醇洗滌液，減壓蒸餾回收甲醇后進行生化處理，達標后排放，對收集的洗去樹脂間雜質的荷載蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，泵入甲醇積濃度為60～80％的脫氧充氮甲醇-水洗脫液以3～6BV/h的流速洗脫被吸附的蘿卜硫素，直至甲醇體積濃度為60～80％的脫氧充氮甲醇-水洗脫液的耗量達到SP850或聚酰胺吸附樹脂柱體積的5～10BV時止，分別收集荷載蘿卜硫素的洗脫液和脫附蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，對于收集的脫附蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，進行再生處理，對于收集的荷載蘿卜硫素的甲醇洗脫液，泵入反滲透器中，在壓力低于0.4MPa下進行反滲透濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素的質量濃度達到20～30％時為止，分別收集反滲透截留液和濾過液，對于收集的反滲透截留液，泵入真空濃縮機中，在真空度為0.06～0.09MPa、溫度為30～45℃的條件下，進行真空濃縮，直至濃縮液無甲醇味時為止，就制備出蘿卜硫素初步純化濃縮液，對于收集的反滲透濾過液，進行減壓蒸餾回收甲醇后進行生化處理，達標后排放；

(6).制備高純度蘿卜硫素凍干物

第(5)步完成后，先將第(5)步制備的蘿卜硫素初步純化濃縮液通過0.22um微孔過濾膜過濾，再泵入以反相C18硅膠為填料的制備型液相色譜柱中，蘿卜硫素初步純化濃縮液體積與C18硅膠填料質量之比為1mL∶50～80g，接著控制色譜條件進行制備分離蘿卜硫素，具體的色譜條件為：檢測波長為245nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL·min-1；A組分為甲醇，B組分為超純水，梯度洗脫程序為：在0min～15min區間，流動相中的A組分由5％上升至25％，B組分由95％下降至75％，在15min～75min區間，流動相中的A組分由25％上升至65％，B組分由75％下降至35％，收集37～41min區間的洗脫液，在35～45℃下進行真空濃縮，直至濃縮液中蘿卜硫素質量濃度達到30～50％時，就制備出蘿卜硫素濃縮液，將該蘿卜硫素濃縮液置于凍干機中，在25～45Pa真空度、-50～-60℃溫度下，進行冷凍干燥24～36h，就制備出純度為98％以上的蘿卜硫素，經核磁共振、液質聯機和旋光儀分析鑒定，所制備出的蘿卜硫素的化學結構為1-異硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷；

(7)制備再生樹脂柱

向第(5)步收集的脫附了蘿卜硫素的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱泵入3～4BV的無水甲醇，以2～5BV/h的流速洗脫樹脂吸附的雜質，分別收集洗脫液和脫附雜質的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，對收集的甲醇洗脫液，減壓蒸餾回收甲醇后分別收集甲醇和濃縮液，對于收集的甲醇進行脫水處理，制備出無水甲醇，對于收集的洗脫雜質的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，用1～2BV的蒸餾水以2～5BV/h的流速洗滌，分別收集經該蒸餾水洗滌的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱和洗滌液，對收集的蒸餾水洗滌后的SP850或聚酰胺吸附樹脂柱，即為再生樹脂柱，可再次用于純化蘿卜硫素粗提液，對于收集的洗滌液，可用于配制脫氧充氮甲醇-水洗脫液。