[發(fā)明專利]一種賴草屬植物根尖染色體制片方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410252224.1
• 申請日: 2014-06-10
• 公開（公告）號: CN104006997A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李媛;蔡振媛;張毓;喻鳳;林麗;劉瑞娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院西北高原生物研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域中植物染色體中期分裂相標(biāo)本的制備方法，尤其涉及一種賴草屬植物根尖染色體制片方法。

背景技術(shù)

染色體是細胞核中的遺傳物質(zhì)，不同物種的染色體都有相對穩(wěn)定而又特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。染色體制片是細胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究生物遺傳變異、物種演化、分類、遠緣雜交以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間關(guān)系所不可缺少的重要手段。植物染色體制片的基本流程包括取材、預(yù)處理、固定、解離、染色、制片及鏡檢等。染色體制片是以體細胞分裂中期染色體為研究對象，但分裂中期持續(xù)的時間很短，需要對材料進行合適的預(yù)處理，使染色體停留在分裂中期。預(yù)處理對染色體制片的質(zhì)量至關(guān)重要，是染色體制片成敗的關(guān)鍵步驟。

傳統(tǒng)的預(yù)處理方法主要有：低濃度的秋水仙素溶液法，飽和的對二氯苯水溶液法，低濃度的8-羥基喹啉溶液法，α-溴萘的飽和水溶液法，低溫法等。秋水仙素、對二氯苯、8-羥基喹啉、α-溴萘等藥物具有阻止或破壞紡錘體形成的作用，毒性大，易對實驗人員造成傷害。而低溫法，實驗時間長，一次處理需要24至64小時，且效果不穩(wěn)定。20世紀中葉，?stergren發(fā)現(xiàn)笑氣具有阻止微管形成的作用，可用于制備植物染色體中期分裂相標(biāo)本。與傳統(tǒng)方法相比，高壓笑氣法具有兩大優(yōu)點：短時間內(nèi)可獲得更多的分裂相細胞，安全、低毒、對實驗人員身體損害小。

賴草屬（Leymus?Hochst.）的植物是適應(yīng)性較廣的禾草，稍喜濕潤，又頗耐干旱，還能適應(yīng)輕度鹽漬化的生境。土壤生態(tài)適應(yīng)幅度廣，從暖溫帶、中溫帶的森林草原到干草原、荒漠草原、草原化荒漠以及4500米以上的高寒地帶都有分布。該屬多數(shù)種類是畜牧業(yè)上的優(yōu)良牧草，通過引種馴化，可培育為適應(yīng)我國西北干旱地區(qū)、輕鹽漬化土壤刈牧兼用的栽培草種。賴草屬的植物除作飼用外，根可入藥，具有清熱、止血利尿作用；又可用作防風(fēng)固沙或水土保持草種。賴草屬植物的一些種具有穗長、粒大、抗逆強的特點，還是小麥等作物現(xiàn)代育種的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效、安全的賴草屬植物根尖染色體制片方法。

為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種賴草屬植物根尖染色體制片方法，包括以下步驟：

⑴取材：賴草（L.?secalinus）種子在25℃恒溫條件下萌發(fā)后5~7日，取生長旺盛的盆栽賴草的白色新根1.5~2cm，并將其放入一個敞口的1.5mL的內(nèi)壁附著水分的離心管中；

⑵在25~27℃條件下，將所述步驟⑴中裝有根尖的離心管置于高壓容器裝置內(nèi)，通入0.4~0.8MPa?N₂O進行預(yù)處理，3~3.5h后即得預(yù)處理后的新根；

⑶將所述預(yù)處理后的新根用濾紙吸干水分，采用卡諾氏液固定20~24h，得到固定后的新根；

⑷將所述固定后的新根用蒸餾水漂洗3次，吸干水分后在體積濃度為45%的冰乙酸中解離2~10min，得到解離后的新根；

⑸將所述解離后的新根中的水分吸干后置于載玻片上，用干凈的刀片去掉根尖的最前端的根冠區(qū)0.5~1.5mm，取分生區(qū)0.5~1.5mm的長度，加一滴體積濃度為45%的冰乙酸，蓋上蓋玻片，蓋玻片的一側(cè)墊一薄刀片，用鑷子的基部輕輕敲擊蓋玻片，使組織成為一薄層，取走所述薄刀片，然后在酒精燈的火焰上烘烤至微熱，在所述蓋玻片上加一吸水紙，用拇指擠壓所述蓋玻片使細胞充分分散，得到壓片；

⑹將所述壓片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行照相，以便進行熒光原位雜交，最后用玻璃刀做好蓋玻片位置的標(biāo)記，將做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

所述步驟⑵中預(yù)處理過程是指壓強按恒定值的方式通入N₂O進行或壓強按梯度遞增的方式通入N₂O進行。

所述步驟⑶中的卡諾氏液是由無水乙醇與冰醋酸按3mL：1?mL的比例混合而成。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明采用高壓笑氣對實驗材料進行預(yù)處理，處理效果穩(wěn)定，制片成功率高，較其它傳統(tǒng)方法，取樣時間不受限制，處理時間由幾十小時縮短為幾小時。同時，本發(fā)明預(yù)處理過程所用試劑安全、低毒、對實驗人員身體損害小。

2、本發(fā)明獲得的染色體樣片經(jīng)鏡檢和顯微檢測，可以發(fā)現(xiàn)染色體形態(tài)好且分散好的細胞比較多（參見圖1），可用于熒光原位雜交實驗，為賴草基因資源利用、遺傳育種等后續(xù)研究奠定良好基礎(chǔ)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。