[發明專利]一種利用重組Bacillus subtilis全細胞轉化膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮的方法

有效

• 申請號: 201410249906.7
• 申請日: 2014-06-05
• 公開（公告）號: CN103981207B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 饒志明;許正宏;邵明龍;張顯;徐美娟;楊套偉;李會
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P33/00;C12R1/125
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技術領域

一種利用重組Bacillus?subtilis全細胞轉化膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮的方法，屬于基因工程和酶工程領域。

技術背景

甾體藥物可通過全合成或對天然甾體化合物的降解和其官能團的轉化獲得，甾體藥物具有很強的抗感染、剛過敏、抗病毒和抗休克等藥理作用。隨著時代的不斷發展，甾體藥物已經成為僅次于抗生素的第二大類藥物，2000年甾體藥物在全球藥物市場的銷售額已突破200億美元，約占世界醫藥總銷售額的6％。

甾體激素類藥物分類：腎上腺皮質激素，包括氫化可的松，強的松等。可治療阿狄森氏癥，抗炎，抗過敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白異化和促進蛋白合成，主要用于治療蛋白質增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。

早期合成甾體藥物的原料大多從動物組織液中直接提取，由于這些原料的含量低、來源少、合成路線復雜、回收率低、代價高昂，不能滿足生產的需要。薯蕷皂素的發現和應用，為甾體藥物的工業化生產提供了豐富而又廉價的原料，但是生產過程需要消耗大量的薯蕷皂素，使皂素價格不斷上升，增加了生產成本，且生產過程嚴重污染環境。

膽甾-4-烯-3-酮，作為膽固醇的氧化產物，可作為減肥食品添加劑或抗高脂血癥藥物抑制人體內脂肪的積累防止發生肥胖及相應的一些癥狀，而且不會出現臨床上的異?，F象和致癌特征。在治療肝病和防止皮膚角質化抵抗衰老也具有一定的價值，還可作為合成一些藥物激素的重要原料。其合成方法有化學合成法和微生物轉化法。微生物法具有成本低、對環境溫和等優點，越來越受到人們的重視。世界先進國家目前進行甾體藥物制備，大多以動植物甾醇為起始原料進行微生物轉化，得到甾體藥物中間體后，再進一步制備。

膽固醇氧化酶(Cholesterol?oxidase，ChOx，EC1.1.3.6)又稱3-β-羥基氧化還原酶，是膽固醇代謝過程中的關鍵酶，屬于黃素蛋白酶類，以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基，能專一性地催化膽固醇轉化為膽甾-4-烯-3-酮，它作為一種檢測用酶，應用于醫療檢測領域。同時，在食品開發、醫療保健、臨床監測、生物農藥等方面具有廣泛應用價值。對膽固醇氧化酶(ChOx)的深入研究對整個甾體藥物行業的發展意義深遠。生產更高附加值的膽甾-4-烯-3-酮最直接有效的方法就是以膽固醇為底物，通過微生物一步轉化。

近年來，眾多學者成功實現了來源于不同菌株的ChOx的外源表達。不同來源的ChOx在大腸桿菌系統中表達時，由于大腸桿菌菌株本身為條件致病菌，所以將ChOx在大腸桿菌中進行異源表達存在一定的安全隱患。

本發明通過質粒pMA5，實現了分枝桿菌膽固醇氧化酶ChoM1和ChoM2在Bacillus?subtilis168中的可溶性過量表達，酶活分別達到5.27U/mg和7.44U/mg，全細胞轉化膽固醇24h后轉化率達67％和83％。分枝桿菌ChoM在枯草系統中表達及全細胞轉化膽固醇均為首次報道，且重組子表達的酶活及膽固醇的轉化率均較高。枯草芽孢桿菌作為安全穩定的工業生產菌株，培養條件簡單，發酵周期短，成為微生物甾醇發酵工業潛在生產菌株。

發明內容

本發明的目的在于提供：通過基因工程手段來獲得具有全細胞轉化生產膽甾-4-烯-3-酮能力的微生物的方法。對構建的重組菌株進行酶活力及發酵性能進行研究發現膽固醇氧化酶ChoM1和ChoM2活力分別為出發菌的5.2和7.3倍左右，并且得到了較高的轉化率。為微生物發酵生產膽甾-4-烯-3-酮的工業化提供了有益的指導。

本發明的技術方案：是以基因工程為手段構建一株全細胞轉化膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮B.subtilis，以TLC及HPLC為方法檢測發酵液中產物的生成，篩選陽性重組子，通過酶活力和發酵性能的檢測來確定其目標酶的活力及底物轉化率。本發明成功構建了一株以膽固醇為底物全細胞轉化為方法的高產膽甾-4-烯-3-酮的枯草芽孢桿菌工程菌株，其膽固醇氧化酶活力和底物轉化率較出發菌株有較大提高。

主要試劑：膽固醇購自國藥集團化學試劑有限公司，膽甾-4-烯-3-酮購自美國SIGMA公司重組菌株構建方法：

(1)膽固醇氧化酶(ChOx)基因全序列的克隆