[發(fā)明專利]利用Tem-PCR技術(shù)檢測多種致病菌的PCR檢測通用引物對

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410249870.2
• 申請日: 2014-06-06
• 公開（公告）號: CN103981278A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉忠梅;徐義剛;李淑云;李蘇龍;曲敏;莫春生
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42;C12R1/19;C12R1/01
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測多種致病菌的PCR檢測通用引物對。

背景技術(shù)

目前對致病菌的檢測方法主要有國標(biāo)法、酶聯(lián)熒光免疫檢測法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、金標(biāo)試紙法、DNA探針技術(shù)、LAMP恒溫擴(kuò)增法,這些方法都有存在不足之處，即檢測通量不高。多重PCR方法是提高檢測通量的基本方法。許多高通量技術(shù)，如基因芯片法、高效液相色譜法都基于多重PCR方法。但多重PCR技術(shù)引物設(shè)計困難，常常出現(xiàn)擴(kuò)增效率不均衡問題，造成假陰性結(jié)果。同時還容易出現(xiàn)引物二聚體，給檢測帶來了難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對多重PCR存在的問題，采用靶序列富集多重PCR(target，enrichedmultiplex?PCR，Tem-PCR)技術(shù)，它的原理是針對待擴(kuò)增的每一種靶序列，設(shè)計特異性引物，再編制一個通用引物(SuperPrimer)與之相聯(lián)，形成嵌合引物，利用嵌合引物和通用引物(SuperPrimer)進(jìn)行擴(kuò)增。其獨(dú)特之處在于嵌合引物的濃度極低，用在PCR的最初幾個循環(huán)中富集目標(biāo)序列。只有超級引物的濃度足以進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，這樣克服多重PCR的擴(kuò)增偏愛性問題，解決了傳統(tǒng)的多重PCR技術(shù)導(dǎo)致的假陰性結(jié)果問題。

本發(fā)明的目的在于提供一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測多種致病菌的PCR檢測通用引物對，本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)實現(xiàn)：

一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測多種致病菌的PCR檢測通用引物對，如下：

上引物Super-F：如序列表Seq?ID?No.1所示，

下引物Super-R：如序列表Seq?ID?No.2所示。

本發(fā)明的另外一個目的是提供一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測多種致病菌的PCR檢測嵌合引物組，由3對引物對組成，其中：

用于檢測腸出血性大腸桿菌O157：H7引物對為：

上引物O157TEM-F：如序列表Seq?ID?No.3所示，

下引物O157TEM-R：如序列表Seq?ID?No.4所示；

用于檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌引物對為：

上引物單增TEM-F：如序列表Seq?ID?No.5所示，

下引物單增TEM-R：如序列表Seq?ID?No.6所示；

用于檢測沙門氏菌引物對為：

上引物沙門TEM-F：如序列表Seq?ID?No.7所示，

下引物沙門TEM-R：如序列表Seq?ID?No.8所示。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測多種致病菌的方法，包括如下步驟：

(1)、PCR模板的制備；

(2)、合成一對非同源性通用引物，保證這對引物與細(xì)菌沒有同源性，

上引物Super-F：如序列表Seq?ID?No.1所示，

下引物Super-R：如序列表Seq?ID?No.2所示；

(3)、利用NCBI網(wǎng)站，選擇致病菌保守區(qū)域基因設(shè)計并合成3對嵌合引物對；

確定腸出血性大腸桿菌O157：H7的靶基因為rfbE，設(shè)計引物對：

上引物O157TEM-F：如序列表Seq?ID?No.3所示，

下引物O157TEM-R：如序列表Seq?ID?No.4所示；

單核細(xì)胞增生李斯特菌的靶基因為hly，設(shè)計引物對：

上引物單增TEM-F如序列表Seq?ID?No.5所示，

下引物單增TEM-R：如序列表Seq?ID?No.6所示；

沙門氏菌的靶基因為invA，設(shè)計引物對：

上引物沙門TEM-F：如序列表Seq?ID?No.7所示，

下引物沙門TEM-R：如序列表Seq?ID?No.8所示；

(4)、Tem-PCR檢測多種致病菌的PCR條件的優(yōu)化。

本發(fā)明還具有如下特征：

如上所述一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測多種致病菌的方法，其中步驟(3)所述Tem-PCR檢測多種致病菌的PCR條件的優(yōu)化結(jié)果如下：