[發明專利]基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法

有效

• 申請號: 201410249829.5
• 申請日: 2014-06-07
• 公開（公告）號: CN104152544B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 李燕強;郭羽白;潘志強;曹君利
• 申請（專利權）人: 徐州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所32220
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明涉及一種DNA測序方法，具體是一種基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法。

背景技術

當前正在發展的新型DNA測序技術主要集中在非電泳的手段上。從總體上來看，這類技術可以分成四大類:第一類是合成測序，在堿基加入到延伸的DNA鏈的過程中進行檢測；第二類是雜交測序法，通過制備一組高密度寡核昔酸微陣列芯片的雜交信號，進行目標基因的序列鑒定；第三類為分子影像技術，一系列可以在單分子的水平上進行測序的技術；最后一類技術是誘導DNA分子蜿蜒通過非常細微的小孔，在這個過程當中借助于電子學或者光學的方法對堿基進行讀出，也稱作納米孔測序。

傳統的雜交測序方法，是把一系列長度為K個堿基共4k條序列固定在芯片上，然后把標記的待測DNA模板去雜交，通過檢測雜交信號來確定該序列的雜交序列譜。如果要測定長DNA序列，那么需要合成的探針需要量很大，成本倍數增加。更重要的是該方法有假陽性高的缺點。

我們之前公開的的“一種基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法”(專利號：ZL200710131536)，先把待測模板固定于芯片上，然后用一套雜交探針進行雜交，同時加入DNA聚合酶引物熒光標記的堿基同，達到平行地測定大批量的DNA序列。但是該方法仍然存在一些缺點：DNA聚合酶對未端倒數第五個堿基開始的識別能力比較差。

發明內容

本發明提供一種基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，目的是克服傳統的雜交測序方法假陽性高的缺陷，并解決現有方法探針合成量大、成本高昂、雜交探針短等問題，實現高通量，低成本，高靈敏度和快速測定短片段DNA序列。

本發明是以如下技術方案實現的：一種基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，確定未知DNA模板的堿基信息是通過DNA模板與多條探針平行雜交并連接標記的探針，通過檢測是否有標記物連接，根據堿基互補原理確定未知DNA模板是否有對應的四個或四個以上連續堿基的信息；即通過對DNA模板重復“雜交一連接一檢測”步驟來實現，能夠解決假陽性及成本高的問題。即DNA序列確定是通過一末端為已知堿基的DNA雜交引物平行地與待測DNA序列經過多次連接、洗脫、檢測來實現，包括如下步驟:

步驟1)連接：混合DNA雜交引物中的一條與一套標記DNA探針及連接緩沖液，在連接酶的作用下，在DNA雜交引物的確定堿基末端連接上標記DNA探針；通過芯片掃描儀讀取延伸堿基的信息，確定未知DNA模板上的包含數個堿基的序列；

步驟2)變性洗脫：用DNA變性試劑把待測DNA恢復單鏈DNA狀態；

步驟3)重復：再將另一末端已知堿基序列不同的DNA雜交引物按步驟1)與未知DNA模板雜交并進行步驟2)，確定未知DNA模板上的包含數個堿基的不同序列；用不同的DNA雜交引物重復上述過程，直到完成DNA序列測。

所述的確定未知DNA模板的DNA序列是根據DNA雜交引物己知堿基和所連接的DNA熒光探針，通過堿基互補原理確定。

所述的DNA雜交引物是指能和且只能和所有DNA模板中的一段通用特定序列雜交的寡核酸片段。在DNA模板制備過程中，通過連接或者在擴增過程中引入與特定的DNA雜交引物互補的一段通用序列，其中引入的該段通用序列應與模板中任何一段序列片段有區別，即模板中只有該段通用序列能夠與該特定的DNA雜交引物實現雜交。

所述的雜交DNA引物，其中有一末端的3個或3個以上堿基為已知堿基，優選3個至5個，最優選4個；另一端帶有1個或以上堿基，其中堿基為四種堿基中不限定的任意一種，或者用通用堿基dI代替；優選1至5個。在最優選的情況下，即一末端為四個已知堿基，DNA雜交引物序列特征可以5'(N)nXYZK3'表示，其中為N為四種堿基T,A,G,C中不限定的任意一種，或者可用通用堿基工來代替，n為2-4的整數；X,Y,Z，K均是選自T,A,G,C中的確定的一種堿基。如此，序列XYZK有4⁴＝256種不同組合，即本發明所述的方法，最少可以在合成256種不同DNA雜交引物的條件下實現。

所述的未知DNA模板，是指通過常規的PCR，滾環擴增、固相擴增以及橋式擴增等增加基因組中感興趣的目的序列量的方法擴增后的待測DNA序列或其序列片斷。擴增可以是單重的，即一次擴增一個目的片斷，也可以是多重的，即一次擴增多個目的片斷。未知DNA模板通過化學或者物理方法可以固定在平面基片上，也可以固定在“96,384孔板”或者各種修飾的珠子等載體上，還可以同時固定多個DNA模板，也包括固定單個DNA模板。