[發明專利]基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法

有效

• 申請號: 201410249829.5
• 申請日: 2014-06-07
• 公開（公告）號: CN104152544B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 李燕強;郭羽白;潘志強;曹君利
• 申請（專利權）人: 徐州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所32220
• 代理人: 周愛芳

1.一種基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，其特征在于確定未知DNA模板的堿基信息是通過DNA模板與多條標記DNA探針平行雜交并連接標記DNA探針，通過檢測是否有標記物連接，根據堿基互補原理確定未知DNA模板是否有對應的四個或四個以上連續堿基的信息；即通過對DNA模板重復“雜交一連接一檢測”步驟來實現；即DNA序列確定是通過一套一個末端包含有4個己知堿基的DNA雜交引物與一套標記DNA探針在連接酶的作用下平行地與待測DNA序列經過多輪連接、檢測來實現；所述DNA雜交引物是5’p-NNNN 3’或者5’NNNN3’；當所述DNA雜交引物是5’p-NNNN 3’時，采用序列為序列1-4的一套標記DNA探針；當所述DNA雜交引物是5’NNNN3’時，采用序列為序列5-8的一套標記DNA探針；其中N為四種堿基T、A、G、C中任意一種或者通用堿基I，W、X、Y、Z均是選自T、A、G、C中的確定的一種堿基，構成序列確定的已知堿基末端；DNA雜交引物中XYZW組成256種不同序列，構成一套DNA雜交引物；所述DNA雜交引物，當已知堿基末端位于5’末端，為使連接反應能進行則該5’末端含有磷酸基團；當已知堿基末端位于3’末端，為使連接反應能進行則該3’末端含羥基基團且5’末端為非磷酸基團；

所述方法包括如下步驟:

步驟1)連接：混合DNA雜交引物中的一條與一套標記DNA探針及連接緩沖液，在連接酶的作用下，在DNA雜交引物的已知堿基末端連接上標記DNA探針；通過檢測信號強度讀取連接標記DNA探針的信息，確定未知DNA模板上的包含數個堿基的序列；

步驟2)變性洗脫：用DNA變性試劑把待測DNA恢復單鏈DNA狀態；

步驟3)重復：再將另一末端已知堿基序列不同的DNA雜交引物按步驟1)與未知DNA模板雜交并進行步驟2)，確定未知DNA模板上的包含數個堿基的不同序列；用不同的DNA雜交引物重復上述過程，直到完成DNA序列測定；即確定未知DNA模板的DNA序列是根據DNA雜交引物己知堿基和所連接的標記DNA探針，通過堿基互補原理確定。

2.根據權利要求1所述的基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，其特征在于，所述的已知堿基為四種堿基dT,dA,dG,dC中的任意一種，且序列是已知。

3.根據權利要求1所述的基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，其特征在于所述的標記DNA探針，其標記DNA探針上非連接末端包含可以直接或者間接檢測的基團或者粒子。

4.根據權利要求3所述的基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，其特征在于，所述的可檢測的基團或者粒子，為修飾熒光基團、生物素或量子點。

5.根據權利要求1所述的基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，其特征在于所述的未知模板DNA，通過化學或者物理方法固定在平面基片、96孔板、384孔板或者各種修飾的珠子載體上；未知單鏈DNA模板可以通過常規的PCR、滾環擴增、固相擴增、橋式擴增以及固相酶連接反應的方法增加其分析用數量，擴增是單重的，即一次擴增一個目的片斷，或是多重的，即一次擴增多個目的片斷。

6.根據權利要求1所述的基于連接酶反應的雜交高通量DNA測序方法，其特征在于所述的DNA變性試劑中含有能降低DNA變性溫度的尿素、NaOH、乙二醇、丙三醇或甲酞胺組分。