[發(fā)明專利]一種注射級α-環(huán)糊精的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410248930.9
• 申請日: 2014-06-07
• 公開（公告）號: CN103981238A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張穎;劉鵬;姜壽俊;孫健;高國銳;劉元鑫;孫劍峰;王學(xué)斌;葛慶燕;閆飛;劉駿;郭鳳霞;徐丹
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南康和醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（a）α-CGTase產(chǎn)生菌的誘導(dǎo)表達(dá)：

α-CGTase產(chǎn)生菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后離心，收集上清液即為粗酶液；粗酶液經(jīng)過超濾濃縮得到濃縮粗酶液；

（b）α-CGTase固定化酶的制備：

將環(huán)氧基樹脂加入磷酸緩沖溶液浸泡至溶脹后，加入上述濃縮粗酶液，經(jīng)振蕩固定化反應(yīng)后離心，棄去上清液，加入巰基乙醇封閉剩余的環(huán)氧基團，過濾，洗滌，直至洗出液無酶活性，即得α-CGTase固定化酶，4℃保存，備用；

（c）淀粉的液化：

在分批攪拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl₂后，調(diào)整pH，加入α-CGTase固定化酶并攪拌反應(yīng)得到淀粉液化液；

（d）淀粉的轉(zhuǎn)化：

將α-CGTase固定化酶填充在填充反應(yīng)柱中，兩端用玻璃纖維塞隔離，擰緊兩端旋帽使填充反應(yīng)柱內(nèi)部呈密封狀態(tài)；將液化儲罐中的淀粉液化液用恒流泵輸入填充反應(yīng)柱進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；得到的轉(zhuǎn)化液經(jīng)超濾，透過液為α-環(huán)糊精溶液，截留液繼續(xù)打入填充反應(yīng)柱進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；α-環(huán)糊精溶液加入固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶反應(yīng)，以除去未轉(zhuǎn)化的淀粉，并改善轉(zhuǎn)化液的濾過性；轉(zhuǎn)化液通砂芯漏斗過濾回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，濾液儲存于儲液罐中；

（e）精制純化：

濾液中加入活性炭攪拌后過濾，經(jīng)反滲透膜濃縮，5℃～15℃攪拌，待β-環(huán)糊精重結(jié)晶后，過濾棄晶體，母液經(jīng)過進一步反滲透膜濃縮至α-環(huán)糊精含量在40%～50%時，0℃～5℃攪拌結(jié)晶得α-環(huán)糊精，烘干研磨即得注射級α-環(huán)糊精。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（a）中，所述α-CGTase產(chǎn)生菌為軟化芽孢桿菌（Bacillus?macerans）、嗜熱脂肪芽孢菌（B.Stearothermophilus）或產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella?oxytoca）。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（a）中，所述α-CGTase產(chǎn)生菌為基因工程菌E.coli?BL21（DE3）/pet24a（+），中國典型微生物保藏中心保藏，保藏號：CCTCCM208063。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（b）中，所述環(huán)氧基載體為環(huán)氧基樹脂Eupergit?C_250L。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（b），所述的環(huán)氧基樹脂和酶在pH6～9的磷酸緩沖液中，4℃至室溫反應(yīng)2～24h，將酶固定于樹脂上，制成固載量為10～200mg酶/g樹脂。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（c）中，液化反應(yīng)控制pH5.0～7.0，反應(yīng)溫度40℃～70℃，控制液化D.E值為2.5～4.5。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（c）中，液化反應(yīng)控制pH6.5，反應(yīng)溫度55℃，控制液化D.E值為3.0。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（d）中，所述填充反應(yīng)柱的高徑比為6～9，反應(yīng)液流速為1.0ml/min～2.0ml/min，反應(yīng)溫度30℃～50℃，反應(yīng)時間10min～60min，固定化α-淀粉酶與固定化糖化酶的加入量為投料淀粉量干重的0.03%～0.05%，其中固定化α-淀粉酶與固定化糖化酶的酶活比為1:0.5～1:0.8。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（e）中，加入活性炭3%～8%；反滲透膜采用熱性螺旋反滲透膜，截留分子量為150～300，操作壓力為3.5～5.5MPa，工作溫度為30℃～40℃，流速為20L/h。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于：步驟（e）中，加入活性炭5%，反滲透膜采用熱性螺旋反滲透膜，截留分子量為200，操作壓力為4.0MPa，工作溫度為35℃，流速為20L/h。