[發明專利]一種注射級α-環糊精的制備方法

有效

• 申請號: 201410248930.9
• 申請日: 2014-06-07
• 公開（公告）號: CN103981238A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 張穎;劉鵬;姜壽俊;孫健;高國銳;劉元鑫;孫劍峰;王學斌;葛慶燕;閆飛;劉駿;郭鳳霞;徐丹
• 申請（專利權）人: 濟南康和醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種注射級α-環糊精的制備方法。

技術背景

環糊精是由環糊精葡萄糖基轉移酶酶解淀粉或淀粉類基質產生的由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而形成的一類環狀低聚化合物。根據葡萄糖單元數目的不同，環糊精可以分為α-、β-、γ-、δ-環糊精等，其中最常見的是聚合度為6、7、8的α-、β-、γ-環糊精。

環糊精的立體結構是中空圓筒形，在它的圓筒內部有非極性的C3和C5上的氫以及通過醚鍵連接的氧原子，故圓筒內腔呈疏水性；而葡萄糖的C2和C3上的仲羥基位于圓筒的寬側開口處，C6上的伯羥基位于圓筒的窄側開口處，故圓筒外部呈親水性。由于這種結構，使它具有容納與其形狀和大小適合的疏水性分子或基團嵌入圓筒內而形成包合物的特性。環糊精在包合物中作為“主分子”，在其圓筒內腔將其它物質作為“客分子”包合起來。這種包合物與尿素和硫脲的分子與分子間晶格空洞形成的包合物不同，因環糊精形成的包合物是在空腔內，而不是在晶格中，所以它在水中溶解時，包合物仍然穩定，并不分裂。而且α-環糊精在水中的溶解度大（25℃達到127g/L），且空腔較小，因此在藥物包合中有著重要的作用，并廣泛應用于食品、農業、化學工業等領域。

目前α-環糊精的生產主要采用酶法制備，菌種發酵后，從菌液中通過離心或者板框過濾分離得到α-環糊精葡萄糖基轉移酶（α-CGTase）。同時將淀粉與水調漿制成淀粉乳后升溫至90℃±1℃糊化至固體狀，再加入α-淀粉酶或者α-CGTase攪拌液化。液化后降溫至50℃±1℃，加入環糊精葡萄糖基轉移酶和癸醇，攪拌反應生成α-環糊精-癸醇復合物。過濾除去濾液后，α-環糊精-癸醇復合物經過水蒸汽蒸餾去除癸醇，經過濃縮結晶干燥即得α-環糊精。在此工藝制備過程中，環糊精葡萄糖基轉移酶在水溶液中不穩定，一次性使用難以回收利用，很難連續化生產，且在后續的反應過程中需要對其進行滅活，增加生產成本。在轉化過程中，需要加入不同的有機溶劑，如癸醇等，使α-環糊精包合沉淀下來，再通過水蒸汽蒸餾去除癸醇，但由于癸醇的沸點高達229℃，很難從水溶液中去除。采用水蒸汽蒸餾法需高壓飽和蒸汽蒸餾10至15小時，該法需使用高溫高壓手段，存在能耗過高、危險系數較大、操作復雜、費時（多達15h）、溶媒無法回收利用、有機溶劑易殘留于樣品中等缺點，為實驗室分析和實際生產操作帶來諸多不便。且國內在實際生產過程中，α-環糊精產品的質量較差，尚未有符合注射級藥用標準產品的生產，不利于α-環糊精在醫藥產品的應用。

發明內容

本發明提供了一種注射級α-環糊精的制備方法，其采用環氧基樹脂作為固定化載體得到穩定的α-CGTase固定化酶，并采用無溶劑方法制備α-環糊精，能夠有效地克服現在技術中存在的能耗大，反應強烈，有機溶劑殘留，產品質量低的問題。

本發明所采取的技術方案為：

一種注射級α-環糊精的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（a）α-CGTase產生菌的誘導表達：

α-CGTase產生菌經發酵培養后離心，收集上清液即為粗酶液；粗酶液經過超濾濃縮得到濃縮粗酶液；

（b）α-CGTase固定化酶的制備：

將環氧基樹脂加入磷酸緩沖溶液浸泡至溶脹后，加入上述濃縮粗酶液，經振蕩固定化反應后離心，棄去上清液，加入巰基乙醇封閉剩余的環氧基團，過濾，洗滌，直至洗出液無酶活性，即得α-CGTase固定化酶，4℃保存，備用；

（c）淀粉的液化：

在分批攪拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl₂后，調整pH，加入α-CGTase固定化酶并攪拌反應得到淀粉液化液；

（d）淀粉的轉化：

將α-CGTase固定化酶填充在填充反應柱中，兩端用玻璃纖維塞隔離，擰緊兩端旋帽使填充反應柱內部呈密封狀態；將液化儲罐中的淀粉液化液用恒流泵輸入填充反應柱進行轉化反應；得到的轉化液經超濾，透過液為α-環糊精溶液，截留液繼續打入填充反應柱進行轉化反應；α-環糊精溶液加入固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶反應，以除去未轉化的淀粉，并改善轉化液的濾過性；轉化液通砂芯漏斗過濾回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，濾液儲存于儲液罐中；

（e）精制純化：