[發(fā)明專利]單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410245945.X
• 申請日: 2014-06-05
• 公開（公告）號: CN104004092A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳志偉;郭佳;安明暉;王輝
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市第三人民醫(yī)院;港大科橋有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/79;C12N15/62
• 代理公司: 深圳市中知專利商標(biāo)代理有限公司 44101
• 代理人: 呂曉蕾

1.一種單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素，其特征在于，其由單個基因編碼區(qū)域產(chǎn)生，不包含常規(guī)抗體的CL和CH1結(jié)構(gòu)域，包含由靈活肽段連結(jié)而成的兩個或多個抗體功能結(jié)構(gòu)域scFv以及人免疫球蛋白Fc區(qū)域，且能夠同時與兩個或多個不同HIV相關(guān)抗原表位進行高親和力的結(jié)合。

2.一種單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：篩選目標(biāo)基因，并根據(jù)目標(biāo)基因構(gòu)建中和抗體單鏈scFv基因；

步驟二：將構(gòu)建的一種中和抗體單鏈scFv基因與人hIgG₁-Fc基因進行無縫連接，構(gòu)成IgG免疫粘附素融合基因；

步驟三：通過重疊PCR的方法將另一種中和抗體單鏈scFv基因與上述IgG免疫粘附素融合基因通過一個(Gly₄Ser)₄肽段相連接，構(gòu)建融合基因；

步驟四：將步驟三最后構(gòu)建得到的融合基因整合進優(yōu)化后的pVAX-Opt.載體中，構(gòu)建出單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-IA；

步驟五：將構(gòu)建的單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-IA通過細胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化來得到所需的免疫粘附素。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟一中所述目標(biāo)基因為scFv-Hu5A8基因和scFv-PGT128基因，所述構(gòu)建的中和抗體單鏈scFv基因序列如圖1的scFv-Hu5A8和scFv-PGT128所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟二中構(gòu)建的一種中和抗體單鏈scFv基因為scFv-Hu5A8基因，與人hIgG₁-Fc基因進行無縫連接，構(gòu)建scFv-Hu5A8-IgG基因，構(gòu)建方法如下：

先用設(shè)計好的兩對引物分別PCR擴增scFv-Hu5A8基因和hIgG₁-Fc基因，引物的構(gòu)建原則為：scFv-Hu5A8基因的反向引物和hIgG₁-Fc基因的正向引物有10個堿基的基因重疊，scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG₁-Fc基因的反向引物的末端分別設(shè)計有BamHI和MssI酶切位點；然后以兩種擴增產(chǎn)物為模板，以scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG₁-Fc基因的反向引物為引物再進行PCR擴增，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-IgG。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟三中另一種中和抗體單鏈scFv基因為scFv-PGT128基因，構(gòu)建方法如下：先用設(shè)計好的兩對引物分別PCR擴增scFv-PGT128基因和scFv-Hu5A8-IgG基因；引物的構(gòu)建原則為：scFv-PGT128基因的反向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的正向引物有45個堿基的基因重疊，且scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物的末端分別設(shè)計有BamHI和MssI酶切位點，引物設(shè)計還要引入一個(Gly₄Ser)₄肽段，將scFv-PGT128連接到scFv-Hu5A8-IgG的5'端；然后以兩種擴增產(chǎn)物為模板，以scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物為引物再進行PCR擴增，得到scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟四中是通過BamHI和MssI雙酶切連接法，把上述scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因整合進圖3A所示的優(yōu)化后的pVAX載體中，其中融合基因的5'端以BamHI連接，3'端以MssI連接到載體，從而構(gòu)建出如圖3G所示的單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達質(zhì)粒，即pVAX-SG-Bispecific-IA。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單基因編碼的雙或多價特異性抗HIV免疫粘附素的制備方法，其特征在于，步驟五中細胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化的步驟如下：提前一天將293T細胞以1.5×10⁵個細胞/毫升的密度鋪在細胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染當(dāng)天用PEI轉(zhuǎn)染試劑與單基因編碼雙特異性分泌型免疫粘附素的真核表達質(zhì)粒pVAX-SG-Bispecific-IA充分混合，DNA與PEI轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量比1:3，靜置15分鐘后將PEI-DNA混合物均勻加入293T細胞中，三天后將細胞上清用rProtein?G試劑收集純化分泌的免疫粘附素。