[發(fā)明專利]一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉粳稻的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410245505.4
• 申請日: 2014-06-04
• 公開（公告）號: CN103993039B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李浩;楊劍波;魏鵬程;李莉;楊亞春;倪大虎;宋豐順;倪金龍;秦瑞英;陸徐忠;馬卉
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種利用PMI篩選標(biāo)記，將外源基因?qū)氲介]穎授粉粳稻品種8m30的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

水稻(Oryza?sativa?L.)是我國乃至世界上最重要的糧食作物，世界上60％以上的人口以稻米為主食。近年來面對日益頻繁的干旱、極端溫度等非生物脅迫的影響，人口增長和生態(tài)環(huán)境的壓力，現(xiàn)代生物技術(shù)手段，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物遺傳改良方面的重要性日漸凸顯。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為農(nóng)作物的產(chǎn)量提升、品質(zhì)改良和抗性增強提供了新路徑、開拓了新空間。

隨著轉(zhuǎn)基因作物的種植范圍迅速擴大，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性，引起了廣泛關(guān)注。例如轉(zhuǎn)基因品種花粉外傳會帶來基因漂移，可能產(chǎn)生“超級雜草”等風(fēng)險，但目前由于缺乏實用有效的技術(shù)手段加以克服，比如物理隔離需要一定的空間阻止花粉傳播(水稻需在100m以上)，只適于小面積實驗，在大面積生產(chǎn)中是不切實際的。而閉穎授粉品種在整個授粉過程中，穎花不張開，花藥不外露，花粉不會向外傳播，可以有效抑制花粉外傳，避免基因污染。通過閉穎受體來解決基因污染問題，是目前被認(rèn)為最可行的技術(shù)手段，但目前生產(chǎn)還缺乏實用化的閉穎水稻品種。本實驗室創(chuàng)制的8m30等閉穎授粉粳稻品種，不僅完全閉穎授粉，而且結(jié)實率、株高等重要農(nóng)藝性狀較好，可作為理想的轉(zhuǎn)基因受體應(yīng)用于品種快速遺傳改良，減少生態(tài)風(fēng)險。

現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)化方法，主要使用抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，該類基因可能隨食物進入腸道,存在與腸道微生物基因交換產(chǎn)生耐藥菌株的潛在風(fēng)險，以致影響抗生素的醫(yī)用效果。為了替代抗生素抗性基因，其他類型篩選標(biāo)記基因被陸續(xù)研究開發(fā)，如除草劑抗性基因、氨基酸代謝篩選基因、可視標(biāo)記基因，但這些篩選標(biāo)記基因要么存在類似問題，要么篩選效率和成本不適于規(guī)模化應(yīng)用。而PMI是一種糖代謝基因，廣泛存在于藻類和一些豆科植物中。水稻等高等植物細胞雖能將甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸甘露糖，但由于細胞自身缺乏PMI，不能進一步將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，從而進入糖酵解途徑而被利用，因此PMI可以作為篩選標(biāo)記基因。與抗生素、除草劑等負(fù)選擇不同，甘露糖是進行正選擇，轉(zhuǎn)化的細胞表達PMI基因，可以利用甘露糖為碳源而正常生長，篩選效率高。同時，甘露糖是廣泛存在于海藻、蕨類等植物中的己糖，且PMI的催化產(chǎn)物為6-磷酸果糖，是蜂蜜和果漿的主要成份，二者都是環(huán)境友好的天然物質(zhì)。

但目前還沒有以PMI作為篩選標(biāo)記，高效、簡便的閉穎授粉水稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容

為充分利用具有閉穎授粉性狀的獨特遺傳資源，同時降低使用抗生素或除草劑抗性基因作為篩選標(biāo)記的潛在風(fēng)險，本發(fā)明旨在建立一種以PMI作為篩選標(biāo)記，適用于閉穎授粉粳稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

本發(fā)明的目的是提供一種以PMI作為篩選標(biāo)記，將外源基因?qū)氲介]穎授粉粳稻品種8m30的遺傳轉(zhuǎn)化方法以及相應(yīng)制備轉(zhuǎn)基因水稻植株的方法。本發(fā)明提供了下列技術(shù)方案來實現(xiàn)該目的。

在一個方面，本發(fā)明提供一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉粳稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：

步驟1：分離出水稻種子的胚，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級愈傷組織；

步驟2：將所述次級愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行預(yù)培養(yǎng)；

步驟3：將所述步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶磷酸甘露糖異構(gòu)酶PMI篩選標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸第一預(yù)定時間段；

步驟4：將步驟3處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基，培養(yǎng)第二預(yù)定時間段；

步驟5將步驟4處理后的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)第三預(yù)定時間段；

步驟6將步驟5處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織；

步驟7將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和

步驟8將所述苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根。

在步驟1中，可以先對水稻種子去殼、滅菌后再將胚分離出來。

在一種實現(xiàn)方式中，所述PMI標(biāo)記基因的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。

在一種實現(xiàn)方式中，所述步驟4中采用墊有若干無菌濾紙的培養(yǎng)皿，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基，[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM。優(yōu)選地，墊上三張無菌濾紙在21-23℃條件下培養(yǎng)48小時。