[發(fā)明專利]一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉粳稻的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410245505.4 | 申請日： | 2014-06-04 |
| 公開（公告）號： | CN103993039B | 公開（公告）日： | 2017-01-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李浩;楊劍波;魏鵬程;李莉;楊亞春;倪大虎;宋豐順;倪金龍;秦瑞英;陸徐忠;馬卉 | 申請（專利權(quán)）人： | 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所 |
| 主分類號： | C12N15/84 | 分類號： | C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00 |
| 代理公司： | 北京律譜知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11457 | 代理人： | 黃云鐸 |
| 地址： | 230031 *** | 國省代碼： | 安徽;34 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 利用 pmi 篩選 標(biāo)記 將外源 基因 導(dǎo)入 授粉 粳稻 方法 | ||
1.一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉粳稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：
步驟1：分離出水稻種子的胚，并置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級愈傷組織；
步驟2：將所述次級愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行預(yù)培養(yǎng)；
步驟3：將所述步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶磷酸甘露糖異構(gòu)酶PMI(phosphomannose?isomerase)篩選標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸第一預(yù)定時間段；
步驟4：將步驟3處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基，培養(yǎng)第二預(yù)定時間段；
步驟5將步驟4處理后的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)第三預(yù)定時間段；
步驟6將步驟5處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織；
步驟7將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和
步驟8將所述苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMI標(biāo)記基因的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，
所述步驟4中采用墊有若干無菌濾紙的培養(yǎng)皿，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基，所述農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM；和/或
所述篩選培養(yǎng)基中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM，并且所述篩選培養(yǎng)基含有5g/L蔗糖和10g/L甘露糖；和/或
所述分化再生培養(yǎng)基中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM，并且含有1.5mg/L萘乙酸(NAA)和1mg/L6-芐氨基嘌呤(6-BA)；和/或
所述生根培養(yǎng)基中含0.4mg/L的NAA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括預(yù)定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝膠；和/或
所述步驟3中的與農(nóng)桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中；和/或
所述農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基包括：預(yù)定配比的N6大量元素([NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮；和/或
所述前篩選培養(yǎng)基包括：預(yù)定配比的N6大量元素([NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝膠、250mg/L羧芐青霉素；和/或
所述篩選培養(yǎng)基包括：預(yù)定配比的N6大量元素([NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、5g/L蔗糖、10g/L甘露糖、2mg/L2,4-D、250mg/L羧芐青霉素、3g/L植物凝膠；和/或
所述分化再生培養(yǎng)基包括預(yù)定配比的N6大量元素([NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、1g/L?CH、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)、2.5mg/L?CuSO4、1.5mg/L?NAA、1mg/L6-BA、AA氨基酸、125mg/L羧芐青霉素、2.5g/L植物凝膠；和/或
所述生根培養(yǎng)基包括1/2MS(Murashige&Skoog)基礎(chǔ)鹽(2.l65g/L)、MS維生素、20g/L蔗糖、0.4mg/L?NAA、125mg/L羧芐青霉素、3.5g/L植物凝膠。
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