[發(fā)明專利]一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉秈稻的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410245313.3
• 申請(qǐng)日: 2014-06-04
• 公開（公告）號(hào): CN103993038B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李浩;楊劍波;魏鵬程;李莉;楊亞春;倪大虎;宋豐順;倪金龍;秦瑞英;陸徐忠;馬卉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種利用PMI篩選標(biāo)記，將外源基因?qū)氲介]穎授粉秈稻品種9m90的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

水稻(Oryza?sativa?L.)是我國(guó)乃至世界上最重要的糧食作物，世界上60％以上的人口以稻米為主食。近年來面對(duì)日益頻繁的干旱、極端溫度等非生物脅迫的影響，人口增長(zhǎng)和生態(tài)環(huán)境的壓力，現(xiàn)代生物技術(shù)手段，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物遺傳改良方面的重要性日漸凸顯。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為農(nóng)作物的產(chǎn)量提升、品質(zhì)改良和抗性增強(qiáng)提供了新路徑、開拓了新空間。

隨著轉(zhuǎn)基因作物的種植范圍迅速擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性，引起了廣泛關(guān)注。例如轉(zhuǎn)基因品種花粉外傳會(huì)帶來基因漂移，可能產(chǎn)生“超級(jí)雜草”等風(fēng)險(xiǎn)，但目前由于缺乏實(shí)用有效的技術(shù)手段加以克服，比如物理隔離需要一定的空間阻止花粉傳播(水稻需在100m以上)，只適于小面積實(shí)驗(yàn)，在大面積生產(chǎn)中是不切實(shí)際的。而閉穎授粉品種在整個(gè)授粉過程中，穎花不張開，花藥不外露，花粉不會(huì)向外傳播，可以有效抑制花粉外傳，避免基因污染。通過閉穎受體來解決基因污染問題，是目前被認(rèn)為最可行的技術(shù)手段，但目前生產(chǎn)還缺乏實(shí)用化的閉穎水稻品種。本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制的9m90等閉穎授粉秈稻品種，不僅完全閉穎授粉，而且結(jié)實(shí)率、株高等重要農(nóng)藝性狀較好，可作為理想的轉(zhuǎn)基因受體應(yīng)用于品種快速遺傳改良，減少生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

現(xiàn)有轉(zhuǎn)化方法，主要使用抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，該類基因可能隨食物進(jìn)入腸道,存在與腸道微生物基因交換產(chǎn)生耐藥菌株的潛在風(fēng)險(xiǎn)，以致影響抗生素的醫(yī)用效果。為了替代抗生素抗性基因，其他類型篩選標(biāo)記基因被陸續(xù)研究開發(fā)，如除草劑抗性基因、氨基酸代謝篩選基因、可視標(biāo)記基因，但這些篩選標(biāo)記基因要么存在類似問題，要么篩選效率和成本不適于規(guī)模化應(yīng)用。

因此，目前尚沒有一種適合用于閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化方法的篩選標(biāo)記基因以及相應(yīng)轉(zhuǎn)化方法。

發(fā)明內(nèi)容

PMI是一種糖代謝基因，廣泛存在于藻類和一些豆科植物中。水稻等高等植物細(xì)胞雖能將甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸甘露糖，但由于細(xì)胞自身缺乏PMI，不能進(jìn)一步將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，從而進(jìn)入糖酵解途徑而被利用，因此PMI可以作為篩選標(biāo)記基因。與抗生素、除草劑等負(fù)選擇不同，甘露糖是進(jìn)行正選擇，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)PMI基因，可以利用甘露糖為碳源而正常生長(zhǎng)，篩選效率高。同時(shí)，甘露糖是廣泛存在于海藻、蕨類等植物中的己糖，且PMI的催化產(chǎn)物為6-磷酸果糖，是蜂蜜和果漿的主要成份，二者都是環(huán)境友好的天然物質(zhì)。

為充分利用具有閉穎授粉性狀的獨(dú)特遺傳資源，同時(shí)降低使用抗生素或除草劑抗性基因作為篩選標(biāo)記的潛在風(fēng)險(xiǎn)，本發(fā)明旨在建立一種PMI作為篩選標(biāo)記，適用于閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

具體而言，本發(fā)明的目的是提供一種通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，以PMI(phosphomannose?isomerase，磷酸甘露糖異構(gòu)酶)作為篩選標(biāo)記，將外源基因?qū)氲介]穎授粉秈稻品種9m90的遺傳轉(zhuǎn)化方法，以及利用該方法制備轉(zhuǎn)基因水稻植株的方法。

本發(fā)明提供了下列技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)該目的。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉秈稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：

步驟1：分離出水稻種子的胚，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級(jí)愈傷組織；

步驟2將所述次級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以獲得愈傷組織；

步驟3將步驟2中獲得的所述愈傷組織與攜帶磷酸甘露糖異構(gòu)酶PMI(phosphomannose?isomerase)篩選標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸第一預(yù)定時(shí)間段；

步驟4將步驟3處理后的所述愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基，培養(yǎng)第二預(yù)定時(shí)間段；

步驟5將步驟4處理后的所述愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)第三預(yù)定時(shí)間段；

步驟6將步驟5處理后的所述愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織；

步驟7將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和

步驟8將所述苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根，

其中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM。

優(yōu)選地，所述PMI標(biāo)記基因的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述水稻品種為9m90。