[發(fā)明專利]一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉秈稻的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410245313.3
• 申請日: 2014-06-04
• 公開（公告）號: CN103993038B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李浩;楊劍波;魏鵬程;李莉;楊亞春;倪大虎;宋豐順;倪金龍;秦瑞英;陸徐忠;馬卉
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種利用PMI篩選標(biāo)記將外源基因?qū)腴]穎授粉秈稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：

步驟1：分離出水稻種子的胚，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級愈傷組織；

步驟2將所述次級愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以獲得愈傷組織；

步驟3將步驟2中獲得的所述愈傷組織與攜帶磷酸甘露糖異構(gòu)酶PMI篩選標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌接觸第一預(yù)定時間段；

步驟4將步驟3處理后的所述愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基，培養(yǎng)第二預(yù)定時間段；

步驟5將步驟4處理后的所述愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)第三預(yù)定時間段；

步驟6將步驟5處理后的所述愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織；

步驟7將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和

步驟8將所述苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根，

其中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMI標(biāo)記基因的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻品種為9m90。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步驟4中將所述愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基包括將所述愈傷組織轉(zhuǎn)移到其上墊有一張或多張無菌濾紙的培養(yǎng)皿中21-23℃培養(yǎng)48小時，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基，該農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM；和/或

所述前篩選培養(yǎng)基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM，并且含有30μM氯化鈷；和/或

所述篩選培養(yǎng)基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM，并且含有7.5g/L麥芽糖、12.5g/L甘露糖、30μM氯化鈷；和/或

所述分化再生培養(yǎng)基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM，并且含有30μM氯化鈷、1mg/L激動素(KT)和1mg/L萘乙酸(NAA)；和/或

所述生根培養(yǎng)基中含有0.4mg/L的萘乙酸。